ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ЭШЕРИХИЙ Российский патент 1999 года по МПК C12N1/20 A61K39/108 C12N1/20 C12R1/185 C12R1/19 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности микробиологии, и может быть использовано для выращивания культур эшерихий на простой и дешевой питательной среде без потери ее эффективности.

Культивирование и выделение эшерихий, продуцирующих энтеротоксины, позволяют устанавливать диагноз при токсической форме колибактериоза. Получение термостабильного (ТС) и термолабильного (ТЛ) токсинов необходимо для конструирования химических вакцин против данной патологии.

Известна питательная среда для выращивания культуры эшерихий (см. а.с. N 1472495 по кл. МКИ C 12 N 1/20, опуб. 15.04.89), содержащая гидролизат казеина, фильтрат культуральной жидкости пекарских дрожжей, глюкозу, фосфорнокислый однозамещенный калий, фосфорнокислый двузамещенный натрий, хлористый натрий, очищенный агар-агар и водопроводную воду.

Однако данная среда пригодна только для накопления адгезивных антигенов эшерихий К-99, а продуцируемый токсин диффундирует в агар. Поэтому получить токсин не представляется возможным. Кроме того, технология приготовления этой среды предусматривает самостоятельное получение первичных компонентов (дрожжевой фильтрат и т.д.). А это приводит к длительности и трудоемкости ее приготовления.

Известна питательная среда Мартена для культивирования эшерихий и получения токсиносодержащего материала (см. А.С. Лабинская. "Микробиология с техникой микробиологических исследований". М. "Медицина", 1978, с. 350-351), содержащая пептон и бульон Мартена. Для приготовления пептона требуются свиные желудки, которые необходимо измельчить и подвергнуть воздействию концентрированной соляной кислоты. Данная операция занимает 2-е суток. Кроме того, использовать его можно не ранее, чем через 5 суток после приготовления. Бульон Мартена готовят из мясного фарша "вырезки". Используют хлебопекарные дрожжи. Проводят подщелачивание раствором едкого натра, добавляют ацетат натрия. Бульон Мартена стерилизуют дробно текучим паром 2 дня подряд.

Таким образом, среда Мартена содержит дорогостоящие компоненты. Приготовление ее трудоемко, длительно по времени и не безопасно из-за использования агрессивных химических соединений.

Известна также питательная среда для культивирования эшерихий (см. а.с. N 1750690 по кл. МКИ A 61 K 39/108, опубл. 30.07.92), содержащая перевар Хоттингера, однозамещенный фосфорнокислый натрий, однозамещенный фосфорнокислый калий, хлористый натрий, сернокислый магний, глюкозу и дистиллированную воду.

Однако для приготовления данной питательной среды используют животное сырье из мышечной ткани и поджелудочной железы. Способ предусматривает длительный этап приготовления первичного компонента - перевара Хоттингера (более 10-ти суток).

Таким образом, способ также как и предыдущие аналоги трудоемок и длителен по времени.

Наиболее близкой к заявляемой среде является питательная среда Мунделя (см. Методические указания по получению, очистке энтеротоксинов эшерихий и изготовлению антитоксических сывороток, Харьков, 1993, с. 14), содержащая гидролизат казеина, дрожжевой экстракт, глюкозу, хлорид натрия (NaCl), двузамещенный фосфорнокислый калий (K₂HPO₄), хлористый магний (MgCl₂), сернокислый магний (MgSO₄), хлористое железо (FeCl₃), пептон и дистиллированную воду. Для приготовления среды в 500 мл дистиллированной воды растворяют минеральные компоненты, фильтруют через ватно-марлевый фильтр. В полученный раствор вносят предварительно профильтрованный гидролизат казеина, дрожжевой экстракт и пептон. Объем доводят до литра. Стерилизуют автоклавированием.

Недостатком данной среды является то, что для приготовления данной среды следует самостоятельно готовить как растворы ее минеральных компонентов, так и гидролизата казеина и дрожжевого экстракта, что может привести к получению нестандартных результатов. Кроме того, процесс приготовления среды занимает около 5-ти суток.

Изобретение направлено на решение задачи создания дешевой, простой в изготовлении питательной среды, обеспечивающей как полноценное развитие эшерихий, так и максимальное продуцирование ею токсинов за счет использования готовых промышленно выпускаемых и стандартизованных компонентов.

Для решения поставленной задачи питательная среда для культивирования эшерихий, содержащая гидролизат казеина, пептон, хлористый натрий и дистиллированную воду, дополнительно содержит солевой раствор Хенкса, аминокровин, гемогидролизат и хлористый аммоний при следующем соотношении компонентов, мас.%:
Солевой раствор Хенкса - 30-50
Гемогидролизат - 5-9
Гидролизат казеина - 9-20
Аминокровин - 5-20
Пептон - 0,6-1,5
Хлористый аммоний (NH₄Cl) - 0,08-0,18
Хлористый натрий (NaCl) - 0,08-0,18
Дистиллированная вода - Остальное
В известных заявителю источниках патентной и научно-технической литературы не описано питательной среды для получения ТЛ- и ТС-токсинов E.coli на основе солевого раствора Хенкса, гемогидролизата, гидролизата казеина, аминокровина, пептона и хлористого аммония, что позволяет сделать вывод о наличии в заявляемом объекте изобретения критерия "новизна".

Кроме того, неизвестно использование солевого раствора Хенкса в качестве компонента питательной среды для выращивания эшерихий. Обычно раствор Хенкса используют в качестве компонента при производстве культур тканей (см., например, "Ускоренная микробиологическая диагностика инфекционных болезней животных", М. Россельхозиздат, 1966, с. 73, 80-81; а.с. СССР N 1025722 по кл. C 12 N 1/00, опуб. 30.06.83).

Сказанное позволяет сделать вывод о наличии в заявляемом изобретении критерия "изобретательский уровень".

Солевой раствор Хенкса представляет собой сбалансированный субстрат по макро- и микроминеральному составу (см., например, "Ускоренная микробиологическая диагностика инфекционных болезней животных". М., Россельхозиздат, 1966).

Состав солевого раствора, г:
Хлористый натрий (NaCl) - 0,8
Хлористый калий (KCl) - 0,14
Сернокислый магний (MgSO₄ • 7H₂O) - 0,01
Хлористый магний (MgCl • 6H₂O) - 0,01
Двузамещенный фосфорнокислый натрий (Na₂HPO₄) - 0,006
Однозамещенный фосфорнокислый калий (KH₂PO₄) - 0,006
Хлористый кальций (CaCl₂) - 0,014
Феноловый красный - 0,002
Бидистиллированная вода pH 7-7,2 - До 100
Гемогидролизат - продукт ферментативного расщепления сгустков крови крупного рогатого скота или человека (отходы производства гамма-глобулина) и 5 витаминов в растворе Хенкса. К среде добавляют 10% сыворотки крупного рогатого скота. Содержит все незаменимые аминокислоты. Используется в вирусологии при выращивании первичных перевиваемых линий клеток.

Казеина гидролизат - представляет собой раствор аминокислот и пептидов, получаемый путем гидролиза полноценного белка казеина. Содержит 0,7 - 0,95% общего азота, аминный азот от общего составляет 40 - 60%. 1 л гидролизата содержит 5,5 г натрия хлорида, 0,4 г калия хлорида, 0,4 кальция хлорида и 0,005 магния хлорида, pH раствора 5,7 - 6,7.

Аминокровин - представляет собой неполный гидролизат крови (эритроцитарной массы и сгустков крови) человека. Содержит все свободные аминокислоты (в 100 мл раствора - 4 г аминокислот, что в пересчете на азот составляет 0,7 г). В состав аминокровина входят также глюкоза (5%) и минеральные соли. Реакция раствора нейтральная.

Пептон - порошок желто-кремового цвета, специфического запаха. Пептон - препарат, получаемый в результате неполного ферментативного гидролиза белков. Содержит более 80% полипептидов, в том числе и высокомолекулярные. Необходим как источник белкового питания микроорганизмов.

Хлористый аммоний - представляет собой белый кристаллический, несколько гигроскопический порошок без запаха, солоноватого вкуса, хорошо растворимый в воде. Применяется как универсальный источник азота.

Хлористый натрий - представляет собой белые кубические кристаллы, без запаха, соленого вкуса, хорошо растворяется в воде. Необходим для поддержания осмотического давления в жидкостях.

Питательную среду готовят следующим образом.

Готовят раствор, состоящий из пептона, хлористого аммония, хлористого натрия. Раствор стерилизуют. В полученный раствор добавляют солевой раствор Хенкса, гемогидролизат, казеина гидролизат и аминокровин. Полученную среду больше не стерилизуют.

Пример приготовления питательной среды.

К 28 мл дистиллированной воды добавляют навески солей: NH₄Cl - 0,1 г, NaCl - 0,1 г и пептон a - 0,7 г. Нагревают и при постоянном помешивании доводят до полного растворения. Полученную смесь автоклавируют в течение 30 мин при 121^oC. Стерильный раствор охлаждают до 40^oC и добавляют в него 43 мл раствора Хенкса, 7 мл гемогидролизата, 14 мл гидролизата казеина и 8 мл аминокровина. Полученную среду (pH 7,4-7,6) разливают в стерильные колбы или пробирки.

При бактериологическом изучении питательной среды, приготовленной согласно предлагаемому способу, проводили сравнительные посевы на среду Мартена, среду Мунделя и на заявляемую среду.

В качестве посевного материала использовали 2 токсигеннных штамма эшерихий, продуцирующих термостабильный (ТС) и термолабильный (ТЛ) токсины соответственно.

Посевы инкубировали в течение 7-ми суток при 37^oC. Затем полученные суспензии культур подвергали центрифугированию при 6000 об/мин в течение 30 мин для освобождения от бактериальной массы. Надосадочная жидкость являлась токсигенным материалом. Нативные токсины вводили внутрибрюшинно белым мышам весом 12-14 г в объеме 0,5 мл. Результаты представлены в таблице.

Продуцирование токсигенными штаммами эшерихий как ТС-, так и ТЛ-токсинов на заявляемой среде несколько превосходит продуцирование их на общепризнанных средах (Мартена, Мунделя).

Количественный и качественный состав компонентов среды подобран как экспериментальным путем, так и с учетом новых литературных данных, исходя из физиологических потребностей в питании эшерихий. При этом основными компонентами среды являются стандартные, биозаводского производства растворы Хенкса, аминокровина, гидролизата казеина, гемогидролизата.

Таким образом, заявляемая среда проста в изготовлении, полностью стандартизирована, обеспечивая тем самым полноценное развитие эшерихий и продуцирование ими как ТС-, так и ТЛ-токсинов.

Изобретение предназначено для выращивания культур эшевихий на простой питательной среде без потери ее эффективности. Питательная среда содержит, мас. %: солевой раствор Хенкса 30-50, аминокровин 5-20, гемогидролизат 5-9, гидролизат казеина 9-20, пептон 0,6-1,5, хлористый аммоний 0,08-0,18, хлористый натрий 0,09-0,18, дистиллированную воду - остальное. Изобретение обеспечивает как полноценное развитие эшерихий, так и максимальное продуцирование ими токсинов. 1 табл.

Питательная среда для культивирования эшерихий, содержащая гидролизат казеина, пептон, хлористый натрий и дистиллированную воду, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит солевой раствор Хенкса, аминокровин, гемогидролизат и хлористый аммоний при следующем соотношении компонентов, мас.%:
Солевой раствор Хенкса - 30 - 50
Аминокровин - 5 - 20
Гемогидролизат - 5 - 9
Гидролизат казеина - 9 - 20
Пептон - 0,6 - 1,5
Хлористый аммоний - 0,08 - 0,18
Хлористый натрий - 0,09 - 0,18
Дистиллированная вода - Остальное