СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ L-ФОРМ БЛЕДНЫХ ТРЕПОНЕМ Российский патент 2006 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 

Изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности к конструированию питательных сред, и может быть использовано для получения биомассы L-форм бледных трепонем, необходимой для получения антигена атипичных форм.

Со времени открытия в 1905 году возбудителя сифилиса большинство исследователей, изучавших бледную трепонему, наблюдали ее свойства изменять свою форму и существовать в виде атипичных форм.

Под влиянием неблагоприятных факторов трепонемы в ряде случаев "теряют" клеточную стенку и могут длительное время находиться в организме больного в латентном состоянии. При благоприятных условиях атипичные формы реверсируют в типичные спиралевидные трепонемы, обусловливая обострение заболевания.

L-трансформация - одна из защитных форм трепонем, позволяющая им противостоять действию препаратов, применяемых для лечения больных сифилисом (К.Д.Пяткин, Ю.С.Кривошеев. Микробиология. М.: Медицина, 1980. С.359-360).

Было поставлено много опытов с воздействием на уже развившиеся и развивающиеся культуры физических и биологических факторов, дезинфицирующих веществ, химических соединений и лекарственных средств, в частности антибиотиков, в т.ч. пенициллина в различных концентрациях (В.Н.Беднова. Автореф. канд дис. на соис. ученой степени канд. мед. наук, 1956).

Наиболее распространенными питательными средами для выращивания культурных трепонем являются среды, питательной основой которых является бульон из бычьих сердец с добавлением пептона, гидролизатов, компонентов для регулирования среды, уплотняющих компонентов, например агар-агар (Ю.А.Козлов. Питательные среды в медицинской микробиологии. М.: Медицина, 1950, с.203-206; Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования под редакцией М.О.Биргера. М.: Медицина, 1973, с.47, 92).

Недостатками этих сред являются дороговизна, длительное время культивирования (7-10 суток), низкий выход биомассы.

В последнее время активно разрабатываются искусственные плотные и жидкие питательные среды для выращивания различных микроорганизмов с исключением из пользования пищевых и животных компонентов. В качестве питательной основы используют гидролизат казеина, супернатант, пептон; в качестве источника азота - цистин, аргинин, глутаминовую кислоту; в качестве источников углерода - глюкозу, углеводы; в качестве стимуляторов роста - экстракты кормовых дрожжей, тиамин-бромид с добавлением агара, минеральных солей, сыворотки крупного рогатого скота (АС СССР № 1393849, C 12 Q 1/04, 07.05.85, Бюл. № 17; АС СССР № 1451167, C 12 Q 1/04, 15.01.89, Бюл. № 2; AC СССР № 1189098, C 12 N 1/00, 20.04.95, Бюл. № 11).

Приведенные составы питательных сред не обеспечивают достаточных условий для культивирования биомассы трепонем.

Известна питательная среда для выращивания биомассы трепонем (Патент РФ № 2198920, C 12 N 1/20, C 12 Q 1/04, 20.02.03, Бюл. № 5).

Среда содержит экстракт пищевых дрожжей, триптический гидролизат казеина, экстракт кормовых дрожжей, глюкозу, кислоту тиогликолевую, цистин, хлористый натрий, сыворотку КРС при следующем соотношении компонентов, г/л:

Экстракт пищевых дрожжей (ЭПД)420-440Триптический гидролизат казеина180-200Экстракт кормовых дрожжей (ЭКД)200-210Глюкоза5/6Кислота тиогликолевая0,3-0,4Цистин0,75-0,8Хлористый натрий0,75-0,80Сыворотка КРС90-100Вода дистиллированнаяДо 1 л

Недостатком этого состава является отсутствие L-трансформирующих компонентов, обеспечивающих получение L-форм бледных трепонем.

На этой питательной среде был зарегистрирован выход биомассы бледной трепонемы 1,07 г/л (А.В.Ермолов. Модифицированная тиогликолевая среда для культивирования производственных штаммов Treponema Pallidum: Автореф. дисс.... кандидата мед.наук. - Ростов-на-Дону, 2002, - 12-15 с.).

В 1980 году была впервые разработана методика получения L-форм бледной трепонемы, доказана возможность образования L-форм бледной трепонемы, под действием цианида, ртути, новарсенола, сулемы, но самым сильным индуктором L-трансформации показан пенициллин.

Наиболее близким к заявляемому изобретению является способ, по которому культивирование L-форм осуществлялось путем пассирования культур L-форм на питательной среде в присутствии постепенно возрастающих концентраций пенициллина и инкубации посевов. С целью длительного поддержания культур в L-форме проводили пассажи на жидкой питательной среде, посев инкубировали до появления вторичного роста культуры, затем пересевали на жидкую питательную среду, причем пенициллин вводили в питательную среду в каждом пассаже при появлении первичных признаков роста (АС № 721489, 15.03.1980. Бюл. № 10).

Однако приведенный состав питательной среды не обеспечивал условий для выращивания достаточного количества биомассы L-форм бледных трепонем.

Целью изобретения является подбор состава питательной среды, обеспечивающей повышение выхода биомассы L-форм бледных трепонем.

Поставленная цель достигается тем, что питательная среда для выращивания биомассы L-форм бледных трепонем содержит следующие компоненты, г/л:

Триптический гидролизат казеина180-200Экстракт пищевых дрожжей (ЭПД)420-440Экстракт кормовых дрожжей (ЭКД)200-210Глюкоза5-6Цистин0,75-0,80Кислота тиогликолевая0,3-0,4Хлористый натрий0,75-0,80Сыворотка КРС90-100Глицин0,5-2Натриевая соль бензилпенициллина, ЕД/мл25-10020% раствор едкого натрия и кислота соляная 

для корректировки рН

Вода дистиллированнаяДо 1 л

По отношению к прототипу заявляемое изобретение отличает то, что в качестве индуктора L-трансформации используют глицин и натриевую соль бензилпенициллина, а культивирование L-форм бледных трепонем ведут на питательной среде, содержащей триптический гидролизат казеина, экстракт пищевых дрожжей, экстракт кормовых дрожжей, глюкозу, кислоту тиогликолевую, цистин, хлористый натрий, сыворотку PC, воду дистиллированную.

Приготовление питательной среды с введением дополнительно индукторов L-трансформации в возрастающей при каждом пассаже концентрации обеспечивает получение L-форм бледных трепонем и повышает выход биомассы этих культур.

Возможность осуществления заявляемого изобретения подтверждается примерами конкретного выполнения.

Пример 1. В варочно-паровой котел сливают из расчета на один литр среды 180 г триптического гидролизата казеина, 440 г экстракта пищевых дрожжей, 210 г экстракта кормовых дрожжей, добавляют 0,75 г хлористого натрия, 0,75 г цистина, предварительно растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды при постоянном добавлении 20% раствора едкого натрия до его полного растворения.

В смесь доливают дистиллированной воды до 1 л и добавляют 10% воды на выкипание, подщелачивают смесь 20% раствором едкого натрия до рН 8,0-8,2. Кипятят 20 минут без цистина и 5 минут с цистином при постоянном перемешивании. Добавляют 5 г глюкозы, 0,4 г тиогликолевой кислоты, фильтруют через полотно и разливают в стерильные пробирки и бутылки, стерилизуют при 110°С (0,5 атм). Перед посевом микроорганизмов добавляют сыворотку КРС в количестве 90 г. Выращивание производят в термостате в анаэробных условиях при 37°С. После появления первичных признаков роста в питательную среду вводили 0,5 г глицина и 25 ЕД/мл натриевой соли бензилпенициллина и выращивали в тех же условиях 10-14 дней. Морфологию полученных культур изучали методом темнопольной и электронной микроскопии. Результаты показали незначительный полиморфизм клеток. Выход биомассы составил 1,23 г/л.

Пример 2. Выполняется аналогично примеру 1, только индукторы вводили в среду в концентрации 2 г/л глицина и 100 ЕД/мл натриевой соли бензилпенициллина. При микроскопии полученных культур выявлена недостаточно высокая степень трансформации. Выход биомассы - 1,34 г/л.

Пример 3. Выполняется аналогично примеру 1, только индукторы вводили в среду в концентрации 1 г/л глицина и 50 ЕД/мл натриевой соли бензилпенициллина. Использованием темнопольной и электронной микроскопии для морфологической оценки трансформации обнаружено большое количество полиморфных клеток. Выход биомассы составил 1,48 г/л.

Таким образом, результаты микроскопии показали наиболее оптимальный состав среды с содержанием индукторов в концентрации 1 г/л глицина, и 50 ЕД/мл натриевой соли бензилпенициллина приводили к выраженному полиморфизму клеток бледных трепонем после первого пассажа культур.

Изобретение реально осуществимо. Использование изобретения в биотехнологии позволит увеличить выход биомассы L-форм бледных трепонем для последующего получения антигена атипичных форм.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению питательных сред для культивирования L-форм бледных трепонем. Способ предусматривает культивирование L-форм бледных трепонем на питательной среде, содержащей триптический гидролизат казеина, экстракт пищевых дрожжей, экстракт кормовых дрожжей, глюкозу, цистин, кислоту тиолгликолевую, хлористый натрий, сыворотку КРС, глицин, натриевую соль бензилпенициллина. Изобретение позволяет повысить выход биомассы L-форм бледных трепонем.

Способ культивирования L-форм бледных трепонем путем пассирования культуры L-форм на питательную среду, инкубирование, внесение при каждом пассаже при появлении первичных признаков роста индуктора L-трансформации в возрастающей концентрации и инкубирование посевов, отличающийся тем, что в качестве индуктора L-трансформации используют глицин в количестве 0,5-2,0 г/л и натриевую соль бензилпенициллина в количестве 25-100 ЕД/мл, а культивирование L-форм бледных трепонем ведут на питательной среде, содержащей триптический гидролизат казеина, экстракт пищевых дрожжей, экстракт кормовых дрожжей, глюкозу, кислоту тиогликолевую, цистин, хлористый натрий, сыворотку КРС, воду дистиллированную при следующем содержании компонентов, г/л:

Триптический гидролизат казеина180-200Экстракт пищевых дрожжей (ЭПД)420-440Экстракт кормовых дрожжей (ЭКД)200-210Глюкоза5-6Цистин0,75-0,80Кислота тиогликолевая0,3-0,4Хлористый натрий0,75-0,80Сыворотка КРС90-100Вода дистиллированнаяДо 1 л