СПОСОБ ПРИЖИЗНЕННОЙ ДИАГНОСТИКИ ЛИСТЕРИОЗА Российский патент 1997 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к области ветеринарной и медицинской микробиологии. Преимущественная область применения диагностика листериоза животных и человека. За аналог принята публикация Дзантиева Б.Б. Егорова А.М. "Современное состояние и перспективы развития ИФА". Журн. Всесоюзн. хим. общества им. Д. И. Менделеева. 1982, т.27.24.с.142 149, где указаны такие преимущества данного метода диагностики как высокая специфичность, чувствительность, быстрота. Прототипом является способ прижизненной диагностики листериоза, основанный на использовании комплекса методов РСК и РА, рекомендованных наставлением по "Лабораторной диагностике листериоза животных и людей". М. 1987 г. Данный комплекс методов разрабатывался и внедрялся в практику 30 20 лет тому назад и за это время установлено, что он не является достаточно специфичным и чувствительным, поэтому не позволяет на основе его результатов поставить диагноз на листериоз.

Предлагаемый способ устраняет указанные недостатки, что позволяет использовать его для прижизненной диагностике листериоза.

Целью изобретения является изыскание способа прижизненной диагностики листериоза, обеспечивающего получение результатов в короткие сроки с максимальной точностью.

Сущность изобретения заключается в разработке способа прижизненной диагностики листериоза методом постановки непрямого твердофазного ИФА. Отличительными существенным признаком объекта изобретения от прототипа являются
1. Уменьшение сроков получения результатов до суток, способ прототип рекомендует сроки 2 21 дня.

2. Высокая специфичность и чувствительность. Все положительно реагирующие в РСК сыворотки положительны и в предлагаемом способе диагностики, но их титр в 100 200 раз выше, чем титр рекомендуемый способом прототипом. Коммерческая листериозная сыворотка УНИИЭВ для РСК с титром 1:20 в ИФА обладала активностью в титре 1:1000.

Предлагаемый для диагностики листериоза способ у больных на 10 15 - 20-й день выявляет рост титра антител, регистрируемых в величинах 1:1000, 1:8000. Метод, используемый прототипом РА, диагностирует на 10 15 день заболевания максимальный титр антител 1:160 1:320, после чего идет понижение величины титра. Высокая чувствительность предлагаемого способа прижизненной диагностики листериоза позволяет регистрировать у больных антитела в титре 1 32000, показатели неспецифичности антител отсекаются в разведении 1:100 1:500. У способа прототипа диагностический показатель титра антител значительно ниже (1:10 в РСК и 1:40 в РА), наличие ложноположительных реакций не исключается.

Пример.

1. Листериозный антиген разводили 1:2000 в 0,05 М карбонатном буфере (Na₂CO₃ 0,795 г; NaHCO₃ 465 г; NaN₃ 0,100 г; Н₂O 0,500 мл, рН 9,6, использовали также: а) коньюгат, меченный пероксидазой, иммуноглобулины I (Ur r) свиньи против глобулинов кролика. Рабочее разведение 1:300 готовили на ФБР (NaCl 8,0 г; КН₂РO₄ - 0,2 г; HaHPO₄ • 12Н₂O 2,9 г, Н₂O 1000 мг) с добавлением 0,05% твина-20, рН 7,4; б) сыворотки контрольные и исследуемые разводили в ФБР рН 7,4 с 0,05% твина-20; в) в субстрат 5-аминосалициловая кислота, которые готовили на следующей прописи: 80 м 5-аминосалициловой кислоты растворяли в 100 мл горячей (+70^oС) дистиллированной воде и доводили рН до 6,01 раствором NaOH. Перед применением к 9 ч. раствора 5-аминосалициловой кислоты добавляли 1 ч. 0,05% перекиси водорода.

2. Физиологический раствор NaCl с добавлением 0,05% Твина-20 для отмывания пластин; г) для постановки реакции использовали пластины из полистирола с плоским дном (фирмы Jinbro). Каждый компонент в реакции использовали в объеме 0,2 мл; д) полистироловые пластины сенсибилизировали в течение 16 18 ч при 20 22^oС специфическим антигеном в 0,05 М карбонатном буфере рН 9,6 в его рабочем разведении. Пластину отмывали физиологическим раствором рН 7,3 с 0,05% Твина-20. Для этого лунки заполняли этим раствором, встряхивали и выливали, затем вновь заливали раствор и повторяли три раза.

3. Наслаивали 1%-ный раствор БСА на 0,2 М ФБР рН 7,2, выдерживали в течение 1 ч при 37^oС; трехкратно отмывали, как указано в п.2.

4. Наслаивали исследуемые пробы сывороток в ФБР рН 7,4 с 0,05% Твина-20, выдерживали 1 ч при 37^oС; трехкратно отмывали, как указано в п.2.

5. Наслаивали коньюгат в рабочем разведении в ФБР рН 7,4 с 0,05- Твина-20, выдерживали 1 час при 37^oС, трехкратно отмывали, как указано в п.2.

6. Вносили субстратную смесь; пластины выдерживали при 20 25^oС в течение 20 30 мин для визуального или инструментального учета.

Реакцию сопровождали следующими контролями.

1. Контроль субстрата: в 1-й ряд сенсибилизированной пластины на последнем этапе вносили только субстратную смесь, в промежуточные этапы ФБР рН 7,4 с 0,05% Твина-20. Субстратный контроль используется в качестве нулевого в показаниях спектрофотометра.

2. Контроль коньюгата: во 2-й ряд сенсибилизированной пластины вместо сыворотки вносили ФБР рН 7,4 с 0,05% Твина-20. Контроль коньюгата выявляет неспецифическое связывание коньюгата в антигеном.

3. Положительный контроль: положительную коммерческую сыворотку кролика в ФБР рН 7,4 с 0,05% Твином-20 вносили в 3-й ряд сенсибилизированной пластины.

4. Отрицательный контроль: нормальную сыворотку кролика в ФБР рН 7,4 с 0,05% Твина-20 вносили в 4-й ряд сенсибилизированной пластины.

При учете на спектрофотометре (длина волны 450 нм) положительным результатом считали результат с величиной оптической плотности, в 2 раза превышающей оптическую плотность, полученную с контрольной, нормальной сывороткой.

При визуальном учете реакция считалась положительной, если интенсивность окрашивания контрольной отрицательной сыворотки.

Предлагаемый способ прижизненной диагностики листериоза позволяет ставить диагноз на данное заболевание в минимально короткие сроки, обладает высокой специфичностью, чувствительностью.

Использование: ветеринария, медицина, микробиология для прижизненной диагностики листериоза. Сущность изобретения: разработан метод непрямого твердофазного ИФА применительно к листериозной инфекции. Для этого применяют листериозный антиген для ИФА разводимого 1:2000 с последующей сенсибилизацией им полистероловых пластин в течение 16 - 18 ч при 20 - 22^oС и наслаиванием 1% раствора БСА с экспозицией в 1 ч при 37^oС и последующей трехкратной промывкой и дальнейшим наслаиванием исследуемой сыворотки с экспозицией в 1 ч трехкратным отмыванием наслаиванием на 1 ч. коньюгата с дальнейшим трехкратным отмыванием и внесением на 20 - 30 мин при 20 - 25^oС субстратной смеси и в заключении визуальном или инструментальном учете, когда положительным результатом, указывающим на заболевание листериозом, считается интенсивное окрашивание исследуемой сыворотки, значительно превышающей интенсивное окрашивание контрольной отрицательной сыворотки. Целью изобретения является способ прижизненной диагностики листериоза, обеспечивающий получение результатов в короткие сроки с максимальной точностью.

Способ прижизненной диагностики листериоза, включающий применение специфического листериозного антигена и исследуемых сывороток крови, отличающийся тем, что, с целью получения в минимально короткие сроки с высокой точностью результатов, проводится постановка непрямого твердофазного иммуноферментного анализа, заключающегося в использовании листериозного антигена, разводимого 1 2000 в 0,05М карбонатно-фосфатном буфере с последующей сенсибилизацией им полистероловых пластин фирмы Linbro в течение 16 18 ч при 20 22^oС и наслаивании 1% -ного раствора БСА на 0,2М ФБР с экспозицией в 1 ч ± 5 мин при (37± 1)^oС и последующим трехкратным отмыванием ФБР с 0,05% твина-20, с дальнейшим наслаиванием исследуемой пробы сыворотки и экспозицией 1 ч ± 0,5 мин при (37± 1)^oС и последующим трехкратным отмыванием вышеуказанным ФБР и наслаиванием коньюгата в рабочем разведении и экспозиции в 1 ч ± 5 мин и дальнейшем трехкратном отмывании тем же ФБР и внесением субстратной смеси при последующей экспозиции 20 30 мин при 20 25^oС и в заключение визуальном или инструментальном учете, когда положительным результатом, указывающим на заболевание листериозом, считается интенсивное окрашивание исследуемой жидкости, значительно превышающей интенсивное окрашивание контрольной отрицательной сыворотки, или при спектрофотометрическом исследовании, когда положительным результатом является величина оптической плотности, в 2 раза превышающей показатель контрольной, нормальной сыворотки.