Способ селекции слабовирулентных клонов листерий Советский патент 1991 года по МПК C12N15/01 

Изобретение относится к ветеринарной и медицинской микробиологии, связано с получением авирулентных штаммов листерий для создания средств специфической профилактики листериоза и может быть использовано в научно- исследовательских и производственных лабораториях, занимающихся проблемой листериоза.

Целью изобретения является снижение вирулентности клонов за более короткий срок.

Способ заключается в применении в качестве селективных факторов антибиотиков стрептомицина и канамицина с последующим направленным отбором слабовирулентных клонов по морфологическим признакам клеток при микроскопировании, что приводит к 1000-кратному и более снижению вирулентности за счет нового сочетания антибиотиков, а также позволяет избежать испытания на животных вирулентных свойств всех полученных антибиотикоустойчи- вых мутантов, что сокращает время и материальные затраты на их получение и выявление.

Пример. Рабочие растворы стрептомицина и канамицина в ФСБ (фосфатносолевом буферном растворе рН 7,2-7,4) готовят в количестве 3,0 мл каждый с концентрацией 5 мг/мл. Растворы антибиотиков стерилизуют фильтрованием через фильтры с размером пор 0,22 мкм и хранят до применения в

О

с

S

N

замороженном состоянии при (-20)- (И)С.

Бульон й-агар ВН1 готовят по имею- .щимся прописям к соответствующим ере- , дам. Агар ВН1 разливают в чашки Петри диаметром 100 мм по 20 +. 2 мл.

Приготовление антибиотикесодержащего бульона ВН1 проводят добавлением необходимого объема рабочего раствораjg антибиотика к стандартному бульону непосредственно перед посевом листе- рий.

Антибиотикосодержащий агар ВН1 готовят за 1 сут до применения. Для J5 этого к 100 мл расплавленного остуженного до 45-50°С агара ВН1 добавляют необходимое количество рабочих стерильных растворов антибиотиков, тщательно перемешивают и разливают в CTG-JQ рильныа чашки Петри (диаметром 100 мм) по 20+2 мл и хранят при 4 ± 1°С до применения.

Клетки штаммов L, monocytogenes 766

агаре ВН1, содержащем 100 стрептомицина и 50 мкг/мл канамицина,, изучают под микроскопом и определяют размер (длину) клеток по известному методу. Мутантные стрептомицин-кана- мицинустойчивые клетки длиной 2-4 мкм отбирают и определяют их пятидесяти- процентную- летательную дозу (ЛД50) при внутрибрюшинном заражении мышей.

Соответствие размера клеток (длины и их вирулентных свойств () приведены в табл. 1 и 2. Результаты про- веден-ных исследований приведены в таблицах 1 и 2. Связь вирулентных свойств () и размера (длины) му- тантных стрептомицин-канамицинустой- чивых клеток листерий приведена в табл. 1.

Как видно из табл. 1, установлена зависимости между размером клеток и вирулентными свойствами мутантных ан- тибиотикоустойчивых штаммов: клетки слабовирулентных мутантных клонов в

(1а серовар) и 1196 (4Ь серовар) вы- 25 2-3 раза превышают размер клеток ис- ращивают в течение 18+2 ч в 5 мл среды ВН1 при , затем осаждают их 10-минутным центрифугированием при 6000g, ресуспендируют в 0,5 мл стерильного физиологического раствора и ,Q равномерно распределяют по поверхности агара ВН1 в чашках Петри. Через 20- 30 мин в центр чашки наносят 20 мкл раствора стрептомицина, т.е. 100 мкг антибиотика. Чашки инкубируют при 37+2°С в течение 20-24 ч. Выросшие в зоне накалывания стрептомицина колонии, устойчивые к данному антибиотику, отбирают стерильной петлей, высевают в 5 мл бульона ВН1, содержащего 100 мкг/мл стрептомицина, и выращивают в течение 18-20 ч при 37±2 С. Затем клетки осаждают 10-минутным центрифугированием при 6000g, ресуспендируют в 0,5 мл ФСБ раствора и равномерно распределяют по поверх- ности агараВН1,содержащего 100 мкг/мл

стрептомицина. Через 20-30 мин в .центр чашки с агаром накапывают 4 мкл раствора канамицина (20 мкг), после чего чашки инкубируют при

35

40

45

50

ходного вирулентного штамма.

Влияние сочетания антибиотиков стрептомицина и канамицина на вирулентные свойства мутантных штаммов листерий приведено в табл. 2.

Таким образом, результатами исследований показано, что используя сочетание антибиотиков стрептомицина и канамицина в концентрации 100 и 50 мкг/мл соответственно, а также направленный отбор слабовирулентных мутантных клонов in vitro микроскопией по размеру клеток, можно без больших затрат в более короткий срок получить клоны листерий с 1000-кратно ослабленной вирулетностью.

Формула изобретения

Способ селекции слабовирулентных клонов листерий, включающий выращи- вание биомассы исходного штамма, высев ее на содержащие антибиотик среды, | выделение антибио тикоустойчивых мутантов и отбор слабовирулентных клонов,о т- личающийся тем, что, с целью снижения вирулентности клонов за более короткий срок, биомассу исходного штамма выращивают на среде, содержащей 100 мкг/мл стрептомицина и 50 мкг/мл канамицина, а отбор клонов

37+2°С 18-20 ч.

Выросшие в зоне накалывания кана- мищша колонии высевают в 5 мл ВН1 бульона, содержащего 100 мкг/мл

Способ селекции слабовирулентных клонов листерий, включающий выращи- вание биомассы исходного штамма, высев ее на содержащие антибиотик среды, | выделение антибио тикоустойчивых мутантов и отбор слабовирулентных клонов,о т- личающийся тем, что, с целью снижения вирулентности клонов за более короткий срок, биомассу исходного штамма выращивают на среде, содержащей 100 мкг/мл стрептомицина и 50 мкг/мл канамицина, а отбор клонов

стрептомицина и 20 мкг/мл канамицина.проводят по размеру клеток, при этом

Описанную операцию повторяют ещедлина отобранных клеток должна превыраз, повышая концентрацию канамицинашать длину клеток исходного вирулент. до 50 мкг/мл. Колонии, выросшие на ного штамма в 2-3 раза.

агаре ВН1, содержащем 100 стрептомицина и 50 мкг/мл канамицина, изучают под микроскопом и определяют размер (длину) клеток по известному методу. Мутантные стрептомицин-кана- мицинустойчивые клетки длиной 2-4 мкм отбирают и определяют их пятидесяти- процентную- летательную дозу (ЛД50) при внутрибрюшинном заражении мышей.

Соответствие размера клеток (длины и их вирулентных свойств () приведены в табл. 1 и 2. Результаты про- веден-ных исследований приведены в таблицах 1 и 2. Связь вирулентных свойств () и размера (длины) му- тантных стрептомицин-канамицинустой- чивых клеток листерий приведена в табл. 1.

Как видно из табл. 1, установлена зависимости между размером клеток и вирулентными свойствами мутантных ан- тибиотикоустойчивых штаммов: клетки слабовирулентных мутантных клонов в

2-3 раза превышают размер клеток ис-

2-3 раза превышают размер клеток ис- Q

5

0

5

0

ходного вирулентного штамма.

Влияние сочетания антибиотиков стрептомицина и канамицина на вирулентные свойства мутантных штаммов листерий приведено в табл. 2.

Таким образом, результатами исследований показано, что используя сочетание антибиотиков стрептомицина и канамицина в концентрации 100 и 50 мкг/мл соответственно, а также направленный отбор слабовирулентных мутантных клонов in vitro микроскопией по размеру клеток, можно без больших затрат в более короткий срок получить клоны листерий с 1000-кратно ослабленной вирулетностью.

Формула изобретения

Способ селекции слабовирулентных клонов листерий, включающий выращи- вание биомассы исходного штамма, высев ее на содержащие антибиотик среды, | выделение антибио тикоустойчивых мутантов и отбор слабовирулентных клонов,о т- личающийся тем, что, с целью снижения вирулентности клонов за более короткий срок, биомассу исходного штамма выращивают на среде, содержащей 100 мкг/мл стрептомицина и 50 мкг/мл канамицина, а отбор клонов

проводят по размеру клеток, при этом

1640162

. 6

Таблица 1

Изобретение относится к ветеринарной и медицинской микробиологии, связано с получением авирулентных штаммов листерий. Целью изобретения является снижение вирулентных клонов за более короткий срок. Способ заключается в том, что методом селекции на средах с антибиотиками получают клоны, устойчивые одновременно к стрептомицину (100 мкг/мл) и канами- цину (50 мкг/мл), отбирают клоны, клетки которых превышают длину клеток исходного штамма в 2-3 раза, и определяют их вирулентные свойства. 2 та бл. с SS

Штамм L.mono- cytogenes

766

Исходный

Мутанты

1196

Исходный Мутанты

Таблица2

Фенотипическая характеристикаштамма

1,0x10, 8,3x10 2,3x10 1,7x109

3,8x10 4,0x108