Способ получения листериозного антигена Советский патент 1992 года по МПК A61K39/02 

1

&

О

IsS О

Изобретение относится к ветеринарной и медицинской микробнологии и может быть использовано для получения бактериальных диагногтических препаратов

Целью няобретения является повыгае- ние специфичности и актийности аяти гена.

Пример 1, Для изготовления антигена испольэутат штаммы Listsria tnonocytogenea 1-roCraTShiM 766) и 2-го (штамм 634) сероваров.

Расплодки бульонных культур лис- тернй штаммов 1 и 2 сероваров (воз- раст 18-20 ч) засевают на агар Д или МПА с 0, глюкезы, разлиты в мат- ровые колбы. Культиэируют при 37 С в течение 18-2А ч. Работу ведут парал™ лельно с каждым штамт-юм в отдельности До стадии смешивания продукта .после стандартизации. Культуры листерий сьтьшают с поверхности ШA физиологическим раствором хлорцца натрия рН 7,,А. Трижды отмывают от отстатков питательной среды путем центрифугиро- пания при 2000 g в течение 25 fflн, Супернатант удаляют. Полученный оса док ресуспендируют в физиологкгческом растворе хлорида натрия (рН ) Яр в сравнении с оптическ51М стандартом hfyTHocTH, устанавливают кондент- рацию микробных тел в одном кгшлилитре от 5 X 10 до 15 я .

Суспензию биомассы листерий в сте

рильньпс условиях разливают в стаканы дезинтегратора, куда добавляют стеклянные бусы (диаметр бус О,)2 мм), и

подвергают баллистической дезинтеграции .

Условия и режш.1ы дезинтеграции:. объем микробной суспензии в стакане 25 мл; масса стеклянньпс бус 40 г (соответствует объе1-гу 25 мл)| частота колебаний стаканов дезинтегратора . 3600 в мик; продолжителыюсть дезинтеграции 120-150 шн.

Разрутеннута бактериальную суспензию (дезинтеграт) подвергают центрк- фугированию при 10000 g в течение 25 мин, Суспернатант отделяют пипеткой в стерильный флакон и инактиви- руют мертиолятом.в конечной концентрации f S 20000, Потгученный ангигенр

состоящий в основном из фракции- ЦН

Tomiasf-aa и мелких осколков клеточной стенки листерий, проверяют на стори- льность..

g

5 g 5 f

5

Q

,,

0

Стандартизируют по содержанию белка (3jO--,3 мг/мл) и ИК-спектроскопиИ (в диапазоне 780-1500 см ), Затем оС5разцы антигена, полученные из сероваров 11 2 f смешивают в равных пропорциях и разливают в стерильные ампулы по 1 мл, Замораживают в течение 48 ч при температуре минус 40 С, после чего проводят его сублимационную сушку. В сухом антигене определяют остаточную влажность, которая не должна превьш ать 3%.

Питоплазменный листериозный антиген для РСК представляет собой белый порошок с желтоватым оттенком, хорошо растворяющийся в физиологическом рас творе.

Пример 2, Для оценки специфической активности полученного антигена используют положительные и отрицательные (нормальные) сыворотки крови кроликов 5 овец и крупного рогатого скотли

Дополнительные компоненты реакции: 2j5% взнесь эритроцитов барана, ком- комплемент сухой для реакции связывания комплемента и гемолизин, физиологический раствор хлористого натрия рН 7,2,

Реакцию связывания комплемента (РСК) с кcпытye iым антигеном в сравнении с коммерческим антигеном УНИИЭВ ставят согласно наставлению по лабораторной диагностшсе листериоза животных.

Перед ког-гиссионным опытом участвующие в реакции пробь положительных и отрицательных сывороток зашифровывают. .Результаты испытанш1 представ лены в табл. 1 и 2

Как .видно из табл. 1 и,2, предлагаемый антиген Н сравнении с .коммерческим обладает .более высокой активностью и специфичностью: выявляет все ллстериознь е сыворотки и не реагирует с нормапьньп-ш и гетерологическими сьпзоротками.

Таким образом, способ изготовления листериозного антигена для РСК обеспечивает (по сравнению с известным способом) получение высокоактивного н высокоспецифическогр диагностикума, что позволяет резко повысить достоверность результата РСК при листерно- зе Разработанный реш{м лиофилизаиии полученного дизентеграта позволяет выпускать препарат в сухом виде, что увеличивает срок его использования

наблюдения). Применяв- из андартизации препарата, затели белка, остаточИК-спектроскопии, позровать выпуск стандарт- что поньппает его ка

ку но с но с ци ду на ск зи а- ни 30

Формула изобретения

Способ получения листериозного антигена, включающий раздельное культивирование штаммов Listeria nionocytoge- nes 1-го и 2-го сероваров, приготовление микробных суспензий, выделение i

из

0

них л-чтигеиных детер№1НйНт, O4viCT- ку каж.цой жтщкой фракции в центробек- ном поле с получением суперкатан вг с последугат м их смептвайием в соотношении 1 ; 1, о т л и ч а ю, щ и и - с к тем, 4TOf с целью повьшення спе цифичностп и активности целевого продукта j выделение антигенных детерми. нант йсуществляют путем баллистической дезинтеграции микробной суспензии до разрушекия клеточных стеиок, а- О гистку ведут при факторе 1 аэделе- нигт 10000. „.10100 g в тачеште 20- 30 ,

Таблица 1

Изобретение относится к ветеринарной и медицинской микробиологии, В частности к получению диагностических препаратов. Целью изобретения является повышение специфичности и активности антигена. Антиген получают после разрушения бактериальной суспензии методом баллистической дезинтеграции. Длительность дезинтеграции 2-2,5 ч. Частота колебаний стаканов дезинтегратора 3600 200 в 1 мин. Способ дезинтеграции позволяет использовать в антигенном препарате как поверхностные, так и внутриклеточные антигенные детерминанты. Центрифугируют дезинтеграт в режиме 10000+100 g в течение 20-30 мин. Лиофилизагщя антигена удлиняет срок его использования. Стандартизация по белку в пределах 3-3,3 мг/мл, остаточной впазнг- ности и данным ИК-спектроскопки повышает его качество. Полученный антиген по сравненяпо с коммерческим антигеном УНИИЭВ обладает более высокой активностью и специфичностью. Он выявляет все листариозные сьюоротки. Не реагит рует с нормальными и гетерологг1чными сьшоротками. 2 табл.

PeзyлpJraты комиссионных 1:спытан-йй активности и чувствительности листериозного антигена ,чу1я РСК и коммерческого антигена УНКИЭВ с заведомо положительными листериозными сыворотками

Т а б л н

Результаты комиссионных специфичности листериозкого антигена для РСК и коммерческого антигена УНШ ОВ с заведомо отрицательными и гетерологичными cьraopoткa tt{

Предлагаемьо 166 166

2 О О О

164 166

166 166

9 8

Сразу Через 18 ч Срйзу Через 18 ч

44 20 2 О

109

146

6

8