СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА ДЛЯ РЕТРОСПЕКТИВНОЙ ДИАГНОСТИКИ ХЛАМИДИОЗОВ ЖИВОТНЫХ Российский патент 2013 года по МПК A61K39/00 

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к средствам лабораторной диагностики хламидиозов животных.

Хламидиозы - это группа контагиозных заболеваний животных, птиц и человека, вызываемых антигеннородственными и морфологически идентичными микроорганизмами - хламидиями, поражающими практически все системы и органы. Заболевание характеризуется разнообразными клиническими проявлениями: пневмонии, конъюнктивиты, артриты, менингоэнцефалиты, аборты и многое другое.

В настоящее время в ветеринарии для диагностики хламидиоза животных используют реакцию связывания комплемента (РСК), в которой выявляют наличие специфических хламидийных антител с помощью специфического хламидийного антигена. Для постановки РСК используют антиген хламидий, общий для всего семейства Хламидиалес.

Однако недостатком всех известных способов получения антигена является низкая активность и специфичность, приводящая к малоэффективной диагностике хламидиоза в РСК и невозможности ее использования в более чувствительных тестах, например в иммуноферментном анализе (ИФА), кроме того, использование 2-меркаптанола, относящегося к группе сильнодействующих ядовитых веществ, наносит вред здоровью людей и требует специальных условий производства.

При создании изобретения ставилась задача получения хламидийного антигена с высокой активностью и специфичностью, позволяющей проводить диагностику хламидиоза не только в РСК, но и в ИФА, и кроме того, простого, доступного и экологически чистого, при производстве которого не используется вредных для здоровья человека и окружающей среды веществ.

Поставленная задача решается тем, что в способе получения антигена для диагностики хламидиоза животных, включающей инфицирование желточных мешков эмбрионов кур, приготовление из них хламидиосодержащей суспензии, добавление к ней смеси детергентов - додецисульфата натрия и 96,5%-ного этилового спирта до конечной концентрации их, равной соответственно 0,1 и 2%, с последующей выдержкой в течение 96 часов при температуре 37°С, с последующей обработкой суспензии эфиром в соотношении 1:5, соответственно, при периодическом перемешивании, с дальнейшей выдержкой суспензии в течение 24 часов под вытяжной системой при комнатной температуре.

Предложенный способ позволяет повысить активность и специфичность антигена, за счет того что экстракцию антигена эфиром производят не из цельной микробной клетки, а предварительно обработанной, т.е. разрушенной детергентами, где клеточную структуру разрушает додецилсульфат натрия, а этиловый спирт выступает в качестве фиксатора, т.е. предупреждает разрушение данного антигенного комплекса, что улучшает доступность антигена для экстракции эфиром и приводит к повышению степени чистоты и активности полученного антигена. Кроме того, способ получения антигена не включает использование ядовитых веществ, не требует специальных условий производства, т.е. является простым, доступным и экологически чистым.

Способ получения антигена для ретроспективной диагностики хламидиоза животных состоит из нескольких последовательных этапов: получение биомассы хламидий на развивающихся эмбрионах кур; получение полуфабриката антигена, обработка полуфабриката додецилсульфатом натрия и 96,5%-ным этиловым спиртом и экстракция антигена эфиром.

Получение биомассы хламидий на развивающихся эмбрионах кур

Для получения исходного сырья при производстве антигена используют развивающиеся эмбрионы кур, которые заражают в 6-дневном возрасте в желточный мешок суспензией возбудителя хламидиоза (штамм «Ростиново -70») с инфекционным титром 10^-5,5-6,5 ЭЛД₅₀ в 0,3 мл в предварительно разведенной до 10^-4. Далее зараженные эмбрионы инкубируют при 37-38°С. Исходным сырьем для изготовления антигена служат желточные мешки куриных эмбрионов, павших на 5-7 день после инфицирования, которые отбирают в стеклянные флаконы. От каждого эмбриона отбирают 1-2 г хорион-аллантоисной и желточной оболочек вместе с сопутствующим желтком. Хламидиосодержащий материал до использования хранят в замороженном состоянии при минус 20-30°С, во время хранения его подвергают термолизису путем трехкратного замораживания и оттаивания для лучшего отделения тканевого содержимого от элементарных телец хламидий.

Приготовление полуфабриката антигена

Для получения полуфабриката антигена из хламидиосодержащего материала готовят 20%-ную исходную суспензию на 0,2 М фосфатно-буферном физиологическом растворе (ФБР) рН 7,2-7,4 с содержанием 0,5% фенола, для инактивации возбудителя, следующим образом: хламидиосодержащие оболочки быстро размораживают, взвешивают и суспендируют до 20%-ной концентрации на коллоидной мельнице, добавив расчетное количество ФБР. Суспензию центрифугируют при 3000 об/мин в течение 60 минут. В процессе центрифугирования суспензия расслаивается на 3 слоя. Верхний слой желток, нижний слой фрагменты тканей желточного мешка и средний слой собственно суспензия, содержащая элементарные тельца хламидий. После центрифугирования отсасывают средний слой центрифугата - взвесь хламидий. Осадок тканей и верхний желточный слой утилизируют. Для приготовления промышленных объемов антигена целесообразно использовать рефрижераторные центрифуги, рассчитанные на большой объем. Из отечественных моделей наиболее удобной является ЦР6-04 производства ОАО «Завод биофизической аппаратуры» (г.Москва) позволяющая центрифугировать одновременно до 11,0 л суспензии.

Для осаждения хламидий очищенную суспензию центрифугируют при 18-20 тыс. оборотов в минуту в течение 60 минут на высокоскоростных центрифугах. Для центрифугирования больших объемов удобно использовать центрифуги с проточным ротором. Из отечественных центрифуг можно использовать ОТР-101К-01. В процессе центрифугирования хламидии собираются на стенках проточного ротора или на дне стаканов в зависимости от типа центрифуги.

Осадок хламидий ресуспендируется в 0,2 М ФБР из расчета получения первоначального объема. Например, если при производстве первоначально было взято 2,0 кг биомассы, то осадок ресуспендируется в 2,0 л ФБР.

Для обработки полуфабриката антигена используют:

- додецилсульфокислоты натриевую соль (додецилсульфат натрия) C₁₂H₂₅O₄NaS, ТУ 6-09-64-75 в классификации ч. (чистый);

- спирт этиловый ректификованный (C₂H₅OH) 96,5%-ной концентрации, ГОСТ Р 51652-2000;

- эфир диэтиловый, ч.д.а., (C₄H₁₀O) ТУ 2600-001-43852015-10.

Приготовление реагентов.

В полуфабрикате антигена концентрация додецилсульфата натрия и 96,5%-ного этилового спирта должна составлять 0,1% и 2% соответственно, поэтому сначала готовят исходную смесь этих реагентов. Для этого 1,0 г додецилсульфата растворяют в 80 мл дистиллированной воды (для лучшего растворения можно проводить процесс в водяной бане при температуре 40-50°С) и добавляют 20 мл этанола и получают 100 мл смеси, содержащей 1% и 20% реагентов соответственно. Смесь реагентов готовят непосредственно перед использованием.

Эфир используют в готовом виде.

Смесь реагентов добавляют к полуфабрикату антигена, разбавляя в 10 раз, чтобы получить нужную концентрацию реагента. Например, на 900 мл антигена добавляют 100 мл готовой смеси реагентов. Обработку ведут в стеклянных бутылях с герметичными пробками в термостате при 37°С в течение 96 часов, периодически, 2-3 раза в сутки, перемешивая бутыль.

По истечении этого периода к обработанному полуфабрикату добавляют эфир из расчета 1:5 соответственно. На 1000 мл полуфабриката антигена добавляют 5000 мл эфира, герметично закрывают, тщательно перемешивают и оставляют еще на 24 часа под принудительной вытяжной системой при комнатной температуре, периодически перемешивая.

В процессе обработки эфиром полуфабрикат расслаивается на 3 слоя:

- нижний слой: вода (ФБР), содержащий реагенты додецилсульфат и этанол;

- средний слой: клеточный дебрис и балластные вещества;

- верхний слой: эфир с растворенным в нем специфическим хламидийным антигеном.

Через 24 часа верхний слой (эфир) осторожно отсасывают, добавляют к нему ФБР, по объему равный первоначальному объему полуфабриката антигена (1000 мл), и испаряют эфир под принудительной вытяжной системой. В процессе испарения эфира липополисахаридный комплекс (антиген) постепенно полностью переходит в ФБР, в результате чего раствор приобретает белый цвет. Активность и специфичность антигена проверяют в РСК путем его титрования против контрольной положительной и отрицательной сывороток крови животных. Антиген должен реагировать с контрольной хламидийной сывороткой крови и не реагировать с отрицательной сывороткой крови.

Ниже, в таблице №1, приведены результаты испытаний трех серий антигенов, приготовленных по предлагаемому способу. По мере изготовления серий антигенов они исследовались на специфичность и активность и использовались для ретроспективной диагностики хламидиоза у животных.

Для определения специфичности и активности антигенов использовали заведомо отрицательные и положительные сыворотки крови овец, входящие в состав «Набора антигенов и сывороток для серологической диагностики хламидиозов сельскохозяйственных животных» производства ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (Рег.№ПВР-12.7/02109; Сертификат соответствия №РОСС RU.ФВ01.Н21898; ТУ 9388-020-00492374-2007).

Таблица№1 Результаты исследования антигена на специфичность и активность Номер серии антигена Наименование сывороток Титр антигена в РСК 1 хламидийная 1:256 отрицательная 0 2 хламидийная 1:512 отрицательная 0 3 хламидийная 1:512 отрицательная 0

Как видно из таблицы, антиген реагировал с положительной хламидийной и не реагировал с отрицательной сыворотками крови овец, что говорит о его специфичности. Также видно, что титр антигена, изготовленного по предлагаемому способу, со специфической хламидийной сывороткой был в пределах 1:256 - 1:512, что говорит о высокой активности антигена, изготовленного по предлагаемому способу.

Были проведены испытания предлагаемого антигена для диагностики хламидиоза у сельскохозяйственных животных. Для этого использовали сыворотки крови крупного рогатого скота из неблагополучного по хламидийной инфекции хозяйства, где диагноз на хламидиоз был подтвержден выделением возбудителя. Также в опыте использовали сыворотки крови овец, вакцинированных против хламидиоза.

В результате проведенных исследований было установлено, что все испытуемые и контрольные сыворотки, а также антиген, не обладали антикомплементарностью.

Отрицательная контрольная сыворотка не реагировала с антигеном. Титр контрольной хламидийной сыворотки с предлагаемым антигенами был 1:40.

Полученные результаты контролей свидетельствовали о специфичности проведенной реакции с использованием предлагаемого антигена.

Результаты исследований сывороток крови КРС и овец обобщены и представлены в таблице №2.

Таблица №2 Результаты сравнительного исследования в РСК на хламидиоз сывороток крови с двумя специфическими хламидийными антигенами. Наименование групп сывороток Номер пробы Результат исследования (титр) в РСК предлагаемым с антигеном Сыворотки крови крупного рогатого скота, принадлежащие ОАО «им. Токарликова» Альметьевского района Республики Татарстан
  1 1:20 2 1:10 3 1:5 4 - 5 - 6 - 7 - 8 1:10 9 - 10 - 11 1:10 12 - 13 1:10 14 1:10 15 1:10 16 1:10 17 - 18 - 19 1:20 20 -   21 1:10 22 1:5 23 1:20 24 1:20 25 1:20 26 1:5 27 - 28 1:20 29 - 30 1:10 31 1:5 32 - 33 1:5 Итого реагировало проб: 20 Средний титр антител: 1:11,7 Сыворотки крови овец 1 вакц. 1:320 2 вакц. 1:320 3 вакц. 1:160 4 не вакц. - Средний титр антител: 1:266 SS   1:40 SN   -

Из таблицы №2 видно, что из 33 сывороток в титре 1:5 и выше с предлагаемым антигеном реагировало 20 (60%) проб. При этом следует отметить, что титры антител были 1:5-1:20, что соответствует диагностическому уровню. Средний титр антител с предлагаемым антигеном составил 1:11,7.

Сыворотки крови иммунизированных против хламидиоза овец реагировали с предлагаемым антигеном в титрах 1:320, 1:320 и 1:160 соответственно. Средний титр антител у вакцинированных против хламидиоза овец с предлагаемым антигеном был 1:266.

Сыворотка крови овцы, не вакцинированной против хламидиоза, в РСК с хламидийными антигенами не реагировала.

Нами была исследована 141 сыворотка крови различных половозрастных групп крупного рогатого скота из 6 неблагополучных по хламидиозу хозяйств РТ и РФ, полученные данные сведены в таблицу 3.

Таблица №3 Результаты исследования в РСК на хламидиоз сывороток крови с предлагаемым специфическим хламидийным антигеном № п/п Наименование хозяйств Исследовано проб Положительно реагировало в РСК с антигеном известный предлагаемым 1 OOO «Нур-Агро», Ютазинский район РТ 25 5 14 2 OOO а/ф «Сирази», Чистопольский район, нетели 16 4 7 3 ИП «Сулейманов А.И.» Кукморский район 7 2 5 4 OOO «Намус», Кукморский район, вакцинированные 18 10 19 5 «Актай», Мамадышский район РТ 38 8 19 6 OOO «Сергеевское», Саратовская область, Каменский район 37 9 18 Итого по хозяйствам 141 38 (27%) 82 (58%) Средний титр проб (М±м): 7,3±0,43 10,9±0,35

Как видно из таблицы, с предлагаемым антигеном реагировало положительно 82 (58%).

Таким образом, полученный антиген специфичен, обладает высокой чувствительностью и активностью в РСК.

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии. Способ включает инфицирование желточных мешков эмбрионов кур, приготовление из них хламидиосодержащей суспензии и добавление к ней смеси детергентов - додецилсульфата натрия и 96,5%-ного этилового спирта до конечной концентрации их, равной соответственно 0,1 и 2%. Затем суспензию выдерживают в течение 96 часов при температуре 37°С с последующей обработкой суспензии эфиром в соотношении 1:5 соответственно при периодическом перемешивании. Дальнейшую выдержку суспензии проводят в течение 24 часов под вытяжной системой при комнатной температуре. Способ позволяет повысить активность и специфичность антигена, а также исключает использование ядовитых веществ. 3 табл.

Способ получения антигена для ретроспективной диагностики хламидиоза животных, включающий инфицирование желточных мешков эмбрионов кур, приготовление из них хламидиосодержащей суспензии, добавление к ней смеси детергентов - додецилсульфата натрия и 96,5%-ого этилового спирта до их конечной концентрации, равной соответственно 0,1 и 2%, с последующей выдержкой в течение 96 ч при температуре 37°С, с последующей обработкой суспензии эфиром в соотношении 1:5 соответственно при периодическом перемешивании, с дальнейшей выдержкой суспензии в течение 24 ч под вытяжной системой при комнатной температуре.