ИММУНОМОДУЛЯТОР Российский патент 2005 года по МПК A61K31/205 A61P37/00 

Изобретение относится к новым биологически активным веществам из класса алканкарбоновых кислот и может быть использовано в медицине и биологии в качестве основы для создания лекарственных препаратов

В последние годы иммунофармакология уделяет много внимания разработке и изучению специфических средств, стимулирующих или подавляющих иммунные реакции организма. Особый интерес в этом отношении представляют химические соединения, которые могут разнонаправленно влиять на иммунитет, например стимулировать гуморальные и ингибировать клеточные реакции, т.е. проявлять себя одновременно в качестве иммуностимулятора и иммунодепрессанта.

Известный иммуномодулятор синтетической природы Левамизол (М.Д.Машковский. Лекарственные средства. - М., 2001. Стр.194-195) может выполнять функции иммуномодулятора, способного усилить слабую реакцию клеточного иммунитета, ослабить сильную и не действовать на нормальную. Левамизол проявляет дозозависимое воздействие на иммунитет, и применять его, например, в качестве иммуностимулятора нужно с осторожностью, так как при превышении доз возможно не иммуностимулирующее, а выраженное иммунодепрессивное действие в отношении всех реакций иммунитета, причем в некоторых случаях - от малых доз левамизола. Кроме того, применение левамизола вызывает различные побочные явления (повышение температуры, головная боль, нарушение сна, аллергические реакции, агранулоцитоз, лейкопения и др.).

Современные знания о патогенезе многих заболеваний, связанных с нарушением межклональных взаимоотношений иммунокомпетентных клеток и баланса продуцируемых ими цитокинов, выдвигают насущные требования к поиску новых иммуноактивных препаратов. В связи этим представляют интерес препараты, проявляющие при первичном скрининге in vivo на интактных животных разнонаправленное влияние на интегральные показатели - антителообразование и ГЗТ, оказывающие влияние либо только на гуморальный, либо только на клеточный иммунитет и не оказывающие токсического воздействия на организм.

С целью расширения арсенала синтетических средств, обладающих иммуномодулирующими свойствами, предлагается использовать трис-(2-оксиэтил)аммониевую соль 4-хлорфеноксиуксусной кислоты в качестве иммуномодулятора.

Трис-(2-оксиэтил)аммониевая соль 4-хлорфеноксиуксусной кислоты и ее аналоги обладают антиоксидантными свойствами (“Клиническая эффективность и безопасность цефалоспориновых антибиотиков производства ООО “АБОЛмед”. Сб. трудов НИИКИ, АГМУ и МКБ. - Новосибирск, 2002. Стр.179; www.abolmed.ru/pages/article33.htm).

Сущность изобретения заключается в том, что были исследованы иммуномодулирующие свойства трис-(2-оксиэтил)аммониевой соли 4-хлорфеноксиуксусной кислоты по способности данного соединения влиять на количество ядросодержащих клеток крови у мышей (миелоактивные свойства), на количество антителообразующих клеток (IgM AOK) in vivo (первичный гуморальный иммунный ответ) и на гиперчувствительность замедленного типа (клеточный иммунный ответ).

В работе использовали здоровых половозрелых животных мышей - гибридов (CBAxC57BL/6)Fl (CBF1) обоего пола, 8-10 недельного возраста, массой тела 18-20 г. Разброс в группах по исходной массе тела не превышал ±10%. Контрольные и опытные животные одного возраста и получены одновременно из одного питомника ("Рассвет", г. Томск). До и в период эксперимента контрольные и опытные животные содержались в виварии в одинаковых условиях: стандартных пластиковых клетках с мелкой древесной стружкой (не более 10 особей) на стандартном рационе. Все исследования проводились в одно и то же время суток (утром). Полученные данные обрабатывались по непараметрическому критерию U Вилкоксона-Манна-Уитни.

Пример 1. Определение миелоактивных свойств.

Опытной группе животных соединение вводили в дозе 1/10 LD 50 внутрибрюшинно в объеме 0,5 мл растворителя ежедневно в течение 7 дней. Через 24 часа после последнего введения определяли количество ядросодержащих клеток в периферической крови. Контрольным животным в таком же объеме и режиме вводили растворитель (воду). Критерием оценки миелоактивных свойств является изменение в лейкоцитарной формуле ±20%. Результаты выражали в количестве лейкоцитов в одном мл крови и в процентах к соответствующему контролю.

Таблица 1Влияние трис-(2-оксиэтил)аммониевой соли 4-хлорфеноксиуксусной кислоты на количество ядросодержащих клеток крови у интактных мышей CBF1.ГруппаДоза 1/10 LD₅₀ (мг/кг)Кол-во ядросодержащих клеток% к контролюКонтроль (n=14) 9,87×10⁶/мл Соединение (n=15)15012,2×10⁶/мл*+24* достоверно, Р<0,05; n - количество животных.

Как видно из табл.1, соединение достоверно обладает миелостимулирующими свойствами (вызывает увеличение количества лейкоцитов на 24%).

Пример 2. Определение количества Ig M антителообразующих клеток in vivo.

Соединение в дозе 1/10 LD₅₀ и в дозе 1/100 LD₅₀ в объеме 0,5 мл (растворителя) вводили внутрибрюшинно опытным животным один раз в сутки ежедневно в течение 7 дней. Контрольным животным в таком же объеме и режиме вводили растворитель соединения (воду). В день последнего введения соединения животных иммунизировали внутривенно эритроцитами барана (ЭБ) в дозе 0,5×10⁷/мышь. Количество IgM АОК в селезенке мышей оценивали на 4-е сутки после иммунизации по количеству зон локального гемолиза в полужидкой среде модифицированным методом Cunningham (1968). Результаты выражали в абсолютном количестве IgM АОК в селезенке.

Таблица 2Абсолютное количество IgM АОК в селезенке интактных мышей CBF1 под влиянием курсового введения трис-(2-оксиэтил)аммониевой соли 4-хлорфеноксиуксусной кислотыГруппыДоза 1/10 LD₅₀ (мг/кг)IgM АОК/селез.Доза 1/100 LD₅₀ (мг/кг)IgM АОК/селез.Контроль (n=15) 1839 1839Соединение (n=15)15011138*151481* достоверно, Р<0,05; n - количество животных

Как видно из данных таблицы 2, трис-(2-оксиэтил)аммониевая соль 4-хлорфеноксиуксусной кислоты проявляет в дозе 150 мг/кг выраженный стимулирующий эффект на первичный гуморальный ответ.

Пример 3. Реакция гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) in vivo.

Опытной группе животных соединение вводили в дозе 1/10 LD₅₀ внутрибрюшинно ежедневно в течение 5 дней в объеме 0,5 мл. В день последнего введения соединения мышей сенсибилизировали внутрибрюшинным введением 0,25% ЭБ в объеме 0,5 мл; на 4-е сутки после сенсибилизации вводили разрешающую дозу антигена под подошвенный апоневроз правой задней лапы (50% ЭБ в объеме 50 мкл). В контрлатеральную лапу вводили растворитель в том же объеме. Контрольным животньм в таком же объеме и режиме вводили растворитель соединения (воду). Реакцию ГЗТ оценивали по методике локальной ГЗТ (Crowie, 1975). Учет реакции производили через 24 часа после введения разрешающей дозы ЭБ, величину отека оценивали штангенциркулем. Результаты выражали в процентах.

Таблица 3Влияние трис-(2-оксиэтил)аммониевой соли 4-хлорфеноксиуксусной кислоты на гиперчувствительность замедленного типаГруппыГЗТ (%)1. Контроль (n=14)47,52. Соединение 150 мкг/кг (n=15)23,4** достоверно, Р<0, 05; n - количество животных

Как видно из таблицы 3, соединение в дозе 150 мг/кг достоверно ингибирует клеточный иммунный ответ.

Оценивая в целом результаты можно отметить, что по влиянию на миелоактивность и первичный гуморальный ответ трис-(2-оксиэтил)аммониевая соль 4-хлорфеноксиуксусной кислоты может быть отнесена к иммуностимуляторам, а по влиянию на клеточный иммунный ответ - к иммунодепрессантам.

Приведенные примеры иллюстрируют наличие у трис-(2-оксиэтил)аммониевой соли 4-хлорфеноксиуксусной кислоты иммуномодулирующих свойств, что позволит в будущем создавать на ее основе лекарственные средства для лечения различных иммунокомпрометированных состояний.

Предложено: применение трис-(2-оксиэтил)аммониевой соли 4-хлор-феноксиуксусной кислоты, ранее известной как антиоксидант и как добавка в биологически активную питательную среду, в качестве иммуномодулятора. Наличие у трис-(2-оксиэтил)аммониевой соли 4-хлорфеноксиуксусной кислоты иммуномодулирующих свойств позволит в будущем создавать на ее основе лекарственные средства для лечения инфекционно-воспалительных и аутоиммунных заболеваний. При этом стимулирующее действие соединения на количество лейкоцитов и на первичный гуморальный ответ сочетается с подавлением реакции гиперчувствительности замедленного типа. 3 табл.

Применение трис-(2-оксиэтил)аммониевой соли 4-хлорфеноксиуксусной кислоты в качестве иммуномодулятора.