ШТАММ ДРОЖЖЕЙ RHODOSPORIDIUM DIABOVATUM - ПРОДУЦЕНТ КАРОТИНОИДОВ Российский патент 1998 года по МПК C12N1/16 C12P23/00 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается нового штамма дрожжей, используемого для получения каротиноидов, применяемых в животноводстве, пищевой промышленности и медицине.

Известны различные продуценты каротиноидов: дрожжи, грибы, бактерии и микроводоросли. Описанные микроорганизмы отличаются как по уровню накопления каротиноидов и составу пигментного комплекса, так и по условиям культивирования и по видам используемого сырья.

Известен штамм дрожжей Sporobolomyces pararosens T, растущий на среде гидролизат верхового торфа. На 5-ые сутки культивирования штамм накапливает до 3200 мкг/л каротиноидов (авт. св. СССР N 391174, 1973). Недостатками данного штамма являются невысокий уровень накопления каротиноидов и большая продолжительность процесса культивирования.

Известен штамм дрожжей Rhodotorula glutinis Б-71, способный расти на молочной сыворотке (авт. св. СССР N 451743, 1975). Штамм устойчив к низким значениям pH и характеризуется полнотой усвоения лактолы. Однако данный штамм не обеспечивает высокого выхода каротиноидов.

Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому эффекту является штамм дрожжей Rhodotorula glutinis 214 (авт. св. СССР N 531844, 1976). Штамм дрожжей выращивают на минеральной среде с использованием в качестве источника углерода УГВ нефти (1,0-1,5 об.%), углеводов (2-4 об.%) или этанола (1 об.%). При этом дрожжи накапливают до 819 мкг/г каротиноидов на среде с УГВ нефти и до 977 мкг/г каротиноидов на углеводной среде. Недостатком данного штамма является невысокий уровень накопления каротиноидов.

Задача, стоящая перед авторами изобретения, заключалась в получении нового штамма дрожжей, способного накапливать значительные количества каротиноидов на различных источниках углерода.

Технический результат изобретения заключается в получении нового штамма дрожжей Rhodosporidium diabovatum ВКПМ У -2212 с более высокой активностью каротинообразования.

Штамм выделен из почвы методом накопительных культур на минеральной среде с добавлением в качестве источника углерода этанола и глюкозы и последующим рассевом на агаризованной среде сусла. Отбор штамма проводили по активности каротинообразования. Минеральная среда имела следующий состав: (NH₄)H₂PO₄ - 10 г/л, K₂HPO₄ - 10 г/л, MgSO₄ - 0,7 г/л. Концентрация этанола в среде - 0,4 об.%, глюкозы - 0,5 об.%.

Хранят штамм на солодовом сусле-агаре при комнатной температуре при периодических пересевах (2-3 раза в год). Штамм хранят также на солодовом сусле-агаре под слоем вазелинового масла. Пересев осуществляют один раз в 2-3 года.

Культурально-морфологические признаки.

На мальтэкстракте 3-дневная культура при 22^oC имеет клетки от овальных до круглых размером 1,6 x 2-9 мкм. Встречаются отдельные клетки или парами. В жидкой культуре способны образовывать осадок. На агаризованной среде клетки морфологически сходны с клетками на жидком мальтэкстракте. Колонии окрашиваются в кораллово-красный цвет, вязкие, гладкие, блестящие с ровным краем. На среде кукурузный экстракт помимо почкующихся клеток образуется примитивный псевдомицелий. В старых культурах образуется истинный мицелий.

Физиолого-биохимические признаки.

Культура ассимилирует галактозу, сахарозу, мальтозу, целлобиозу, трегалозу, рафинозу, D-ксилозу, L-арабинозу, D-рибозу, рибитол, янтарную кислоту, лимонную кислоту, мелицитозу, α-метил-d-глюкозид, арбутин, крахмал (медленно). Не ассимилирует лактозу, L-рамнозу, эритритол, D-манитол, инозитол, мелибиозу. Утилизирует аммонийный нитратный азот. Для роста не требует витаминов. На среде с 50%-ной глюкозой рост отсутствует. Крахмал не накапливает. Мочевину разлагает. Брожение отсутствует. При температуре 35^oC не растет. Оптимальная температура роста 29-30^oC. Диапазон pH для роста 2,5-7,0. Оптимум pH 5,0-5,5. Аэроб.

Штамм непатогенен.

Биотехнологическая характеристика.

Штамм накапливает до 2000 мкг/г каротиноидов, в том числе до 1000 мкг/г β-каротина.

Состав засевной среды для качалочных колб: (NH₄)H₂PO₄ - 10 г/л, K₂HPO₄ - 10 г/л, MgSO₄ - 0,7 г/л, FeSO₄•7H₂O - 12,5 мг/л, ZnSO₄•7H₂O - 12,5 мг/л, MnSO₄•7H₂O - 12,5 мг/л, NaCl - 6,3 мг/л, pH среды 5,5.

Состав питательной среды для выращивания культуры в ферментере: K₂HPO₄ - 10 г/л, MgSO₄ - 10 г/л, FeSO₄• 7H₂O - 12,5 мг/л, ZnSO₄•7H₂O - 12,5 мг/л, MnSO₄•7H₂O - 12,5 мг/л, NaCl - 6,3 мг/л.

Штамм депонирован в коллекции Всероссийского музея промышленных микроорганизмов института ГосНИИгенетика, регистрационный номер ВКПМ У- 2212.

Пример 1. Штамм дрожжей выращивали в ферментере Ур - 1 л на питательной среде вышеописанного состава. Процесс вели при температуре 29^oC, pH среды 5,5. Титрование осуществляли 6%-ным раствором аммиака. В качестве источника углерода использовали этиловый спирт. Концентрацию спирта в среде поддерживали 0,4 об.%. Время выращивания 72 ч. Содержание каротиноидов в биомассе составило 2000 мкг/г. Содержание β-каротина 975 мкг/г.

Пример 2. Штамм дрожжей выращивали в ферментере Ур - 1 л на питательной среде вышеописанного состава. Условия культивирования описаны в примере 1. В качестве источника углерода использовали фермент ржаной муки состава: содержание редуцирующих веществ - 67 г/л, содержание сухих веществ - 9,0%. Количество ферментолизата ржаной муки, подаваемой в аппарат, составило 75 мл (из расчета, чтобы РВ в среде не превышало 0,5%). Время выращивания 72 ч. Содержание каротиноидов в биомассе составило 1930 мкг/г, в том числе β-каротина 1000 мкг/г.

Пример 3. Штамм дрожжей выращивали в ферментере Ур - 1 л на питательной среде вышеописанного состава. Условия культивирования описаны в примере 1. В качестве источника углерода использовали мелассу (содержание сахарозы в мелассе 43%, сумма сбраживаемых сахаров 44%, pH 6,5). Количество мелассы, подаваемой в аппарат, составило 6,5 мл (из расчета, чтобы концентрация сахарозы в среде не превышала 0,3%). Время выращивания 72 ч. Содержание каротиноидов в биомассе составило 1890 мкг/г, в том числе β-каротина 989 мкг/г.

Таким образом, предлагаемый штамм дрожжей Rhodosporidium diabovatum ВКПМ У -2212 способен накапливать значительные количества каротиноидов на различных источниках углерода.

Использование: микробиологическая промышленность, получение каротиноидов. Сущность изобретения: штамм Rhodosporidium diabovatum выделен из почвы. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ У-2212. При культивировании штамма на питательной среде, включающей источники углерода, азота и минеральные соли, получают биомассу, содержащую 1930-2000 мкг/г каротиноидов, в том числе 975-1000 мкг/г β-каротина.

Штамм дрожжей Rhodosporidium diabovatum ВКПМ У-2212 продуцент каротиноидов.