ШТАММ БАКТЕРИЙ AGROBACTERIUM TUMEFACIENS, ОСУЩЕСТВЛЯЮЩИЙ ДЕГРАДАЦИЮ ФЕНОЛА Российский патент 1997 года по МПК C12N1/20 C02F3/34 C12R1/01 C12N1/20 

Изобретение относится к микробиологии синтетических органических соединений и касается микробиологического разрушения фенола.

Выявлены и описаны штаммы микроорганизмов, способные осуществлять разложение фенола и его производных. Такие штаммы представляют большой интерес для непосредственного использования в качестве биологических деструкторов ксенобиотиков. Известны штаммы, принимающие участие в биологической деградации фенола: Pseudomonas sp. Arthrobacter sp. Acinetobacter sp. Bacillus sp. (1), Pseudomonas putida (2). Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту является штамм Pseudomonas (strain SJ1) (3).

Недостатком известных штаммов является, по мнению авторов, то, что для исследованных штаммов не установлена эффективность деградации фенола, достигаемая в результате культивирования микроорганизмов в сточных водах нефтехимического производства и стоках производств дубильных экстрактов. Штамм Agrobacterium tumefaciens получен путем селекции из культуры Agrobacterium tumefaciens C58.

Целью изобретения является получение нового штамма, осуществляющего биологическую деградацию фенола.

Штамм характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.

Культурально-морфологические признаки
Грамположительные подвижные палочки. Спор не образуют.

На мясо-пептонном агаре образуют гладкие не пигментированные колонии с тенденцией становиться с возрастом бороздчатыми. При росте на мясо-пептонном бульоне культура образует муть с пленкой за 24 36 часов. При росте на висмуто-сульфитном агаре образует сероводород. Рост на средах с углеводами сопровождается образованием внеклеточной полисахаридной слизи.

Физиолого-биохимические признаки
Аэроб. Температурный оптимум 25 30^oC, оптимальный диапазон рН - 6,0 9,0 (табл.1).

Культура медленно разжижает желатину, казеин не гидролизует, не использует целлюлозу, крахмал, хитин. Использует аспарагин как единственный источник углерода и азота. Образует нитриты из нитратов, использует соли аммония, аминокислот как единственный источник азота. Не требует ростовых факторов и аминокислот в среде.

Штамм оксидазоположителен.

Обнаруживает рост на агаре с Са или Na-глицерофосфатом, манитом и нитратами. На лакмусовом молоке культура проявляет нейтральную реакцию, выделяет сыворотку.

Штамм чувствителен к хлорамфениколу, устойчив к тетрациклину, ампициллину.

Штамм идентифицирован по Определителю Берги (8-е издание) как штамм вида Agrobacterium tumefaciens.

Штамм может храниться в лиофилизированном состоянии. Проверка жизнеспособности штамма проводится высевом на мясо-пептонный агар 1 раз в 12 месяцев.

Штамм депонирован в ВКПМ НИИГЕНЕТИКА и ему присвоен коллекционный номер ВКПМ В-6489.

Сущность изобретения поясняется следующими конкретными примерами использования штамма Agrobacterium tumefaciens.

Пример 1. Приведены данные по использованию штаммом Agrobacterium tumefaciens фенола в качестве единственного источника углерода и энергии. Культивирование штамма проводили в жидкой солевой среде следующего состава (в г/л): NH₄Cl 1,0; КН₂РО₄ 2,0; MgSO₄•7H₂O 0,2; микроэлементы;
Посевной материал культуры Agrobacterium tumefaciens получали выращиванием бактерий в пробирках в жидкой солевой среде с добавлением глюкозы до 5 г/л при температуре +30^oC в течение 18 часов. Посевной материал засевали в количестве 0,01% от конечного объема солевой среды. В качестве единственного источника углерода и энергии в солевую среду добавляли фенол до конечной концентрации 50 мг/л и 75 мг/л. Инкубацию культур проводили при +30^oC в течение 5 суток в термостатированных условиях УВМТ-12-250 при 115 об/мин.

На рис. 1 представлены графики изменения оптической плотности клеточной суспензии (ОД₅₉₀) во время роста периодических культур Agrobacterium tumefaciens.

Из рис. 1 следует, что для штамма Agrobacterium tumefaciens наблюдалось существенное изменение оптической плотности клеточной суспензии в 1-е сутки инкубации. В опытах с концентрацией фенола 75 мг/л оптическая плотность культуры достигала в 1-е сутки инкубации 0,2, к 5-м суткам она увеличивалась до 0,3. В среде с начальной концентрацией фенола 50 мг/л оптическая плотность культуры в 1-е сутки достигала 0,24, к 5-м суткам она изменилась незначительно, и составляла 0,29.

Из приведенных данных следует, что культура Agrobacterium tumefаciens способна расти в жидкой минимальной солевой среде с добавлением фенола в качестве единственного источника углерода и энергии в концентрации 75 мг/л и ниже. Наибольший рост культуры наблюдается в 1-е сутки инкубации.

Пример 2. Проводили определение содержания фенола в культуральной жидкости в процессе культивирования штамма Agrobacterium tumefaciens. Для этого из проб культуральной среды удаляли клетки микроорганизмов центрифугированием при 5 тыс. об./мин в течение 15 минут. Определение концентрации фенола в среде проводили с использованием стандартного фотометрического метода (4). Для этого к 5 мл исследуемой пробы последовательно добавляли следующие растворы: 0,03 мл 2%-ного раствора 4-аминоантипирина; 0,1 мл 2н; раствора аммиака; 0,1 мл 2%-ного раствора калия железосинеродистого;
Смесь перемешивали после добавления каждого компонента реакции, и через 10 минут измеряли коэффициент пропускания на фотоэлектрическом концентрационном калориметре КФК-2 при длине волны 540 нм, чувствительности, равной 2. Для каждого опыта коэффициент пропускания определяли как среднее арифметическое из трех измерений. фенола определяли по градуировочному графику, построенному в стандартных условиях определения (табл.2).

Из данных таблицы 2 следует, что в 1-е сутки инкубации штамма Agrobacterium tumefaciens в культуральной жидкости происходило значительное уменьшение количества фенола. В опытах с начальной концентрацией 75 мг/л количество фенола снижалась до 20 мг/л,что составляло 73,3% В опытах с начальной концентрацией фенола 50 мг/л его концентрация снижалась до 17 мг/л, что составляло 66% К 5-м суткам инкубации концентрация фенола в среде культивирования значительно не изменялась и составляла для указанных опытов, соответственно, 69,3 и 70%
Пример 3. Приведены результаты опытов по применению штамма Agrobacterium tumefaciens для биологической очистки вод нефтехимического производства и производства дубильных экстрактов.

Для исследований использовали сточную воду нефтехимического производства, в которой согласно анализам технологическому регламенту производства содержалось 0,09 мг/л фенола, рН 6,6 7,0, и сточную воду производства дубильных экстрактов, содержащую согласно анализам технологического производства 0,75 мг/л фенолов, рН 6,5 7,0. Для проведения микробиологической очистки сточных вод от фенола в несколько колб объемом 250 мл вносили 100 мл сточной воды. Колбы засевали 3% от объема сточной воды посевным материалом, содержащим 10⁷ кл/мл штамма Agrobacterium tumefaciens.

Наращивание биомассы проводили в термостатированных установках УВМТ-12-259 при 220 об./мин, +30^oC в течение 1 7 суток.

В отобранных на 1-е, 3-е и 7-е сутки культивирования штамма пробах сточных вод определяли содержание фенола. Для определения использовали стандартную методику фотокалориметрического определения фенолов согласно методическому руководству по анализу сточных вод нефтеперерабатывающих и нефтехимических заводов (Б).

После отбора пробы сточных вод консервировали для предотвращения окисления фенола. Для этого в колбу с пробой сточной воды добавляли едкий натр из расчета 5 мл 50%-ного едкого натра на 1 л пробы. Затем помещали в перегонную колбу необходимый объем анализируемой сточной воды. В колбу добавляли 10% -ный раствор сернокислой меди (1 мл на 100 мл пробы) и подкисляли разбавленной серной кислотой. После этого из проб отгоняли фенол в перегонном аппарате. Ход определения фенола меняли в зависимости от концентрации фенола в полученном отгоне. При концентрации фенола больше 0,4 мг/л фотокалориметрированию подвергали водные растворы после реакции с 4-аминоантипирином присутствии калия железосинеродистого. При содержании фенолов меньше 0,4 мг/л соединения извлекали экстрагирующей смесью хлороформ- изоамиловый спирт, и фотокалориметрированию подвергали окрашенные растворы экстракта после реакции с 4-аминоантипирином в присутствии калия железосинеродистого. Оптическую плотность окрашенных растворов определяли на фотоэлектрокалориметре КЭФ-2. Содержание фенола в анализируемой пробе находили по калибровочной кривой, которую строили по значениям оптической плотности экстрактов стандартных образцов.

Определяли степень очистки сточной воды в процентах к контролю. В качестве контроля использовали показатель содержания фенолов до инкубации проб с микроорганизмами /0 сут./. Контроль принимали за 100% (табл.3).

Как видно из приведенных в таблице 3 данных, заявляемая культура Agrobacterium tumefaciens активна в реальных стоках нефтехимического производства. Степень биологической очистки от фенола на 1 сутки инкубации составляет 54,2% на 3-ьи сутки 86,3% Культура активна также в стоках производства дубильных экстрактов. Степень очистки на 3-ьи сутки составляла 90,7%
Преимущества штамма
Штамм Agrobacterium tumefaciens осуществляет деградацию фенола. Это свойство позволяет использовать данный штамм для очистки загрязненных жидких сред, если загрязнителем является фенол.

При использовании штамма Agrobacterium tumefaciens для очистки сточных вод от фенола в течение 3 суток степень очистки сточных вод нефтехимического производства достигала около 86% очных вод производства дубильных экстрактов до 90%
1. Giulietti Ana Maria, Silva Humberto J. //Milgen Jornal, 1989, N 5, p. 343-348.

2. Kotturi Goraul, Rodinson Cambol W. Inniss William E. //Appl. Microbiol. Biotechnol. 1991, N 34, p.539-543.

3. Korol Sonia, Orsingher Myriam, Santini Pilar, Moretton Juan, D'Aqvino Miguel//Microbiology, 1989, N 31, p.117-120.

4. Методы органической химии. М, 1963, с.361.

5. Методическое руководство по анализу сточных вод нефтеперерабатывающих м нефтехимических заводов. М. 1977, с.367-382.

Использование: изобретение относится к микробиологии синтетических органических соединений и касается микробиологического разрушения фенола. Сущность изобретения: предложен новый штамм бактерий Agrobacterium tumefaciens, осуществляющий эффективную биологическую деградацию фенола в сточных водах предприятий нефтехимического профиля, а также производства дубильных экстрактов. 1 ил., 3 табл.

1 Штамм бактерии Agrobacterium tumefaciens ВКПМ В-6489, осуществляющий деградацию фенола.