ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS CEREUS ВКПМ В-7164, ОСУЩЕСТВЛЯЮЩИЙ БИОЛОГИЧЕСКУЮ ДЕГРАДАЦИЮ 2,4,5-ТРИХЛОРФЕНОКСИУКСУСНОЙ КИСЛОТЫ Российский патент 1999 года по МПК C12N1/20 C02F3/34 C12N1/20 C12R1/85 

Изобретение относится к микробиологии синтетических органических соединений и касается микробиологического разрушения 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4,5-Т).

Известно, что молекулы 2,4,5-Т обладают токсичными и канцерогенными свойствами, поэтому данное вещество представляет собой значительную опасность для окружающей среды (1). Описано несколько штаммов, принимающих участие в биологической деградации 2,4,5-Т. Это штаммы: Brevibacterium sp., Pseudomonas cepacia, Nocardioides simplex 3E (2 - 5).

Для штаммов рода Bacillus свойство деградации 2,4,5-Т ранее не было установлено.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому положительному эффекту является штамм Nocardioides simplex 3E (5). Штамм может использовать в качестве единственного источника и энергии 2,4,5-Т, может утилизировать хлорбензоаты и некоторые другие хлорароматические соединения.

Недостатком известных штаммов является, по мнению авторов, то, что для этих штаммов не установлена сравнительная эффективность деградации 2,4,5-Т, достигаемая в результате утилизации ксенобиотика в условиях культивирования штаммов в жидкой солевой среде и почве. Оцениваемый эффект касается скорости минерализации 2,4,5-Т и характера продуктов деградации.

Целью изобретения является получение нового штамма, осуществляющего эффективную биологическую деградацию 2,4,5-Т в водной среде и почве.

Новый штамм Bacillus cereus ВКПМ B-7164 получен путем селекции из природных образцов микроорганизмов методом накопительных культур.

Штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) ВНИИ Генетика (г. Москва).

Культурально-морфологические признаки.

Клетки бактерий одиночные, могут располагаться в парах, цепочках, диаметр клеток более 1 мкм. Клетки имеют споры. Споры овальные, локализованы центрально и эксцентрично, спорангии не разуваются. Окраска по Граму положительная. На мясо-пептонном агаре колонии не прозрачные, мелкоскладчатые, беловатые.

Физико-биохимические признаки.

Для культуры характерен аэробный рост, менее выражен рост в анаэробных условиях. Оптимальный температурный диапазон роста от +22^oC до +41^oC, при +4^oC и в интервале +45^oC - +50^oC рост практически отсутствует.

Оптимум pH - 6,8 - 7,0. Рот pH 5,7 рост умеренный.

Штамм ферментирует глюкозу. Штамм гидролизует желатину крахмал, казеин. Проявляет лецитиназную и каталазную активность.

Клетки не обнаруживают амилазной активности. Штамм не использует цитрат, пропиолат, фенилаланин. Не образует кислоту из арабинозы, ксилозы, маннита.

Штамм устойчив к ампициллину, окситетрациклину, стрептомицину. Малоустойчив к хлорамфениколу, тетрациклину.

По совокупности признаков штамм идентифицирован как штамм вида Bacillus cereus ВКПМ B-7164 (Определитель Берги, 9 издание).

Сущность изобретения определяется следующими конкретными примерами использования штамма Bacillus cereus ВКПМ B-7164.

Пример 1. Приведены данные, описывающие характер роста периодической культуры Bacillus cereus ВКПМ B-7164 в водной среде в условиях использования 2,4,5-Т в качестве источника углерода и энергии.

Посевной материал получают выращиванием штамма в пробирках в разбавленном мясо-пептонном бульоне (1МПБ:7H₂O) при температуре 30^oC.

Полученный посевной материал засевают в количестве 0,01% от объема в жидкую солевую среду следующего состава: NH₄Cl - 1 г, K₂HPO₄ - 5 г, MgSO₄•7H₂O - 50 мг, FeSO₄•7H₂O - 5 мг, CuSO₄•5H₂O 0 1 мг, ZnSO₄ - 0,8 мг, 2,4,5-Т - 100 мг на 1 литр, pH - 6,8 - 7,0. Инкубацию культуры проводят при 30^oC в течение 9 суток.

Культивирование производят в термостатированных установках УВМТ-12-250 при 115 - 120 об/мин. Рост контролируют по изменению оптической плотности клетчатой суспензии (ОД₅₉₀) с использованием фотоколориметра КФК-2 при длине волны 590 нм и чувствительности, равной 2. Результаы исследований показывают, что длительность лаг-фазы составляет примерно 5 - 10 часов, экспоненциальной фазы - около 3 суток, стационарной фазы - около 2 суток, затем происходит отмирание культуры.

Пример 2. Приведены результаты анализа динамики содержания 2,4,5-Т в культуральной жидкости штамма Bacillus cereus ВКПМ B-7164. Условия культивирования описаны в примере 1. Анализы проводят согласно методам определения микроколичеств пестицидов с небольшими модификациями (6). Для анализов отбирают по 10 мл культуральной жидкости на 3, 5, 7-е сутки инкубации штамма. Пробы освобождают от клеток штамма центрифугированием при 5000 об/мин в течение 30 мин. Далее жидкость подкисляют до pH 2 добавлением нескольких капель 1H соляной кислоты. В каждую пробу добавляют в качестве стандарта 2,4-Д до конечной концентрации 100 мг/л. Затем из проб проводят 3-кратную экстракцию 2,4,5-Т и 2,4-Д равными объемами хлороформа. После экстракции хлороформ удаляют отгонкой на вакуумном роторном испарителе. Экстракты 2,4,5-Т и 2,4-Д метилируют, переводят в гексан и фракционируют методом тонкослойной хроматографии. Тонкослойную хроматографию проводят на пластинах силуфол UV-254 (Чехия). Сканирование образцов проводят при длине волны 260 - 280 нм в камере Хромоскана (Jouce-Loebl). Для визуальной оценки результатов хроматографии пластины обрабатывают 0,001% раствором бромкредолового зеленого в 96% этаноле. Содержит 2,4,5-Т определяют по калибровочному графику для чистого стандарта 2,4-Д.

В табл. 1 представлены данные, демонстрирующие изменение содержания 2,4,5-Т в культуральной жидкости в зависимости от времени инкубации штамма.

Из данных табл. 1 видно, что в течение 7 суток инкубации штамма происходит постепенное снижение концентрации 2,4,5-Т в культуральной среде. В течение 2-х суток инкубации концентрация 2,4,5-Т снижается до 59,2% и далее к 7 суткам количество 2,4,5-Т уменьшается до 40,5%.

Пример 3. Приведены данные по идентификации продукта деградации 2,4,5-Т, накапливаемых в водной среде в процессе культивирования штамма Bacillus cereus ВКПМ B-7164. Для анализа продукта метаболизма отбирают пробы культуральной среды на 1, 2, 3, 5, 7-е сутки инкубации. Клетки бактерий и проб удаляют центрифугированием при 500 об/мин в течение 30 мин. Затем 2,4,5-Т и продукт деградации трижды экстрагируют равным объемом хлороформа и эфира. Хлороформ и эфир отгоняют на роторном вакуумном испарителе. Экстракты метилируют свежеприготовленным диазометаном, переводят в гексан. Затем объединяют по 0,2 мл полученных проб и объединенную пробу подвергают анализу. Анализ проводят на хромато-масс-спектрометре NERMAG R-30-10 с хроматографом Carlo Erba MEGA 5360. Условия определения: капиллярная колонка 15 м х 0,25 мм, привитая фаза ДВ-1, растворитель - гексан, температура инжектора 200^oС, интерфейса 250^oC, колонки 80 - 250^oC, скорость нагрева 3,5 мин. Масс-спектры электронного удара получают при температуре источника ионов 250^oC, энергии электронов 70 эВ.

В табл. 2 представлен состав идентифицированных продуктов деградации 2,4,5-Т.

Из табл. 2 видно, что в культуральной жидкости не обнаруживаются хлорированные метаболиты бензола, способные оказать отрицательное воздействие на окружающую среду.

Пример 4. Приведены данные, показывающие возможности использования штаммом Bacillus cereus ВКПМ B-7164 фенола, дихлорфенола, 4-хлорфеноксиуксусной кислоты, 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты в качестве единственного источника углерода и энергии. Посевную культуру штамма получают как описано в примере 1. Полученный посевной материал засевают в количестве 0,01% от объема в жидкую солевую среду следующего состава: NH₄Cl - 1 г, K₂HPO₄ 0 2 г, MgSO₄•7H₂O - 50 мг, FeSO₄•7Н₂О - 5 мг, CuSO₄•5H₂O - 1 мг, ZnSO₄ - 0,8 мг на 1 литр, pH - 6,8 - 7,0. В качестве источника углерода и энергии в среды вносят раздельно фенол, дихлорфенол, 4-хлорфеноксиуксусную кислоту, 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту до конечной концентрации 100 мг/л. Инкубацию культур проводят в течение 7 суток в термостате ТС-80 при 30^oC.

В табл. 3 приведена оценка роста культуры Bacillus cereus ВКПМ B-7164.

Из данных табл. 3 следует, что штамм Bacillus cereus ВКПМ B-7164 способен использовать в качестве источников углерода и энергии фенол, 4-хлорфеноксиуксусную кислоту, 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту; не использует дихлорфенол.

Пример 5. Приведены результаты опытов по применению штамма Bacillus cereus ВКПМ B-7164 для биологической очистки почв, загрязненных 2,4,5-Т. Для исследований используют почву промзоны, в которой согласно анализам содержится 100 мг/кг 2,4,5-Т. Для проведения процесса биологической очистки в почву вносят посевной материал культуры из расчета 10⁵ - 10⁶ колониеобразующих единиц на 1 г почвы. Культивирование проводят при 24 - 27^oC в течение 21 суток. Через 1, 5, 10, 14, 21 сутки инкубации проводят отбор почвы в количестве 2 г. Пробы анализируют согласно методам анализа почв с модификациями (7). К каждой пробе добавляют по 10 мл дистиллированной воды. Пробы встряхивают 20 минут на качалке. Данную процедуру повторяют 3 раза. Водную вытяжку объединяют и осветляют центрифугированием при 5000 об/мин в течение 30 мин. Далее жидкость подкисляют до pH 2 добавлением нескольких капель 1H соляной кислоты. В каждую пробу добавляют в качестве стандарта 2,4-Д до конечной концентрации 100 мг/л. Затем из проб проводят 3-кратную экстракцию 2,4,5-Т и 2,4-Д равными объемами хлороформа. После экстракции хлороформ удаляют отгонкой на вакуумном роторном испарителе. Экстракты 2,4,5-Т и 2,4-Д метилируют, переводят в гексан и фракционируют методом тонкослойной хроматографии. Тонкослойную хроматографию и анализ содержания 2,4,5-Т проводят как описано в примере 2.

В табл. 4 представлены данные зависимости изменения содержания 2,4,5-Т от времени очистки почвы. Из табл. 4 видно, что в почве происходит равномерное уменьшение 2,4,5-Т в течение 21 суток. Существенное изменение содержания 2,4,5-Т наблюдается после 10 - 14 дней обработки.

Из данных табл. 4 следует, что культура Bacillus cereus ВКПМ B-7164 активна в реальных условиях загрязнения почв. Степень очистки, достигаемая при использовании заявляемой культуры, составляет 35,8% на 5-е сутки, 42,0% на 10-е сутки и около 50% на 14 - 21-е сутки культивирования.

Преимущества штамма.

Штамм Bacillus cereus ВКПМ B-7164 способен использовать 2,4,5-Т в качестве источника углерода и энергии в водной среде и почве. Эти свойства штамма определяют возможность использование данного штамма для очистки загрязненных жидких сред и почвы, если загрязнителем является 2,4,5-Т.

В результате использования штамма Bacillus cereus ВКПМ B-7164 деградация 2,4,5-Т в описанных условиях культивирования происходит без накопления существенного количества метаболитов, способных оказать токсическое действие на окружающую среду. Это означает, что с использованием штамма можно провести экологически безопасную очистку среды от 2,4,5-Т.

Штамм обладает полисубстратной активностью. Он может использовать в качестве источника углерода и энергии фенол, 4-хлорфеноксиуксусную кислоту, 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д).

Для штамма Bacillus cereus ВКПМ B-7164 установлен спектр чувствительности к антибиотикам. Эти особенности штамма могут быть использованы для тестирования штамма в окружающей среде.

Изобретение касается микробиологического разрушения 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4,5-Т), экологически опасного соединения. Задача решается с помощью нового штамма бактерий Bacillus cereus ВКПМ В-7164, полученного селекцией природных микроорганизмов. Данный штамм способен использовать 2,4,5-Т в качестве источника углерода и энергии. Это обеспечивает возможность его использования для очистки сред и воды, загрязненных 2,4,5-Т. Штамм обладает полисубстратной специфичностью, не накапливает токсичных метаболитов. Изобретение позволяет повысить безопасность очистки и эффективность процесса биологической деградации 2,4,5-Т. 4 табл.

Штамм бактерий Bacillus cereus ВКПМ В-7164, осуществляющий биологическую деградацию 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислоты.