ШТАММ БАКТЕРИЙ GLUCONOBACTER OXYDANS, ОСУЩЕСТВЛЯЮЩИЙ БИОЛОГИЧЕСКУЮ ДЕГРАДАЦИЮ 2,4,5-ТРИХЛОРФЕНОКСИУКСУСНОЙ КИСЛОТЫ Российский патент 1999 года по МПК C12N1/20 C02F3/34 B09C1/10 C12N1/20 C12R1/01 

Изобретение относится к микробиологии синтетических органических соединений и касается микробиологического разрушения 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4,5-Т).

Известно, что молекулы 2,4,5-Т обладают токсичными и канцерогенными свойствами, поэтому данное вещество представляет собой значительную опасность для окружающей среды. Описано несколько штаммов, принимающих участие в биологической деградации 2,4,5-Т. Это штаммы: Brevibacterium sp., Pseudomonas cepacia, Nocardioides simplex 3E (1-4).

Для штаммов рода Gluconobacter свойство деградации 2,4,5-Т ранее не было установлено.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому положительному эффекту является штамм Nocardioides simplex 3E. Штамм может использовать в качестве единственного источника и энергии 2,4,5-Т, может утилизировать хлорбензоаты и некоторые другие хлорароматические соединения (4).

Недостатком известных штаммов является, по мнению авторов, то, что для этих штаммов не установлена сравнительная эффективность деградации 2,4,5-Т, достигаемая в результате утилизации ксенобиотика в условиях культивирования штаммов в жидкой солевой среде и почве. Оцениваемый эффект касается скорости минерализации 2,4,5-Т и характера продуктов деградации.

Целью изобретения является получение нового штамма, осуществляющего эффективную биологическую деградацию 2,4,5-Т в водной среде и почве.

Новый штамм Gluconobacter oxydans N В-7170 получен путем селекции из природных образцов микроорганизмов методом накопительных культур.

Штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) ВНИИ Генетика (г.Москва).

Культурально-морфологические признаки
Клетки штамма представляют собой грамотрицательные коккобациллы, одиночные и в парах. На мясо-пептонном агаре колонии непрозрачные, гладкие, беловатого цвета. На некоторых других средах колонии могут быть полупрозрачными.

При росте на мясо-пептонном бульоне культура образует развитую матовую пленку, среда при этом остается прозрачной. При встряхивании биомассы в жидкой среде ее полного диспергирования не происходит.

Физиолого-биохимические признаки
Для культуры характерен аэробный рост.

Оптимальный температурный диапазон роста от +22^oC до +41^oC, при +4^oC и +45^oC рост умеренный, при +50^oC рост практически отсутствует.

Оптимум pH - 7-8.

Штамм ферментирует глюкозу, лактозу, этанол.

Штамм гидролизует казеин, проявляет лецитиназную, нитратредуктазную и каталазную активность.

Обнаруживает умеренный рост на среде с ксилозой.

Клетки не обнаруживают амилазной активности, не обладают лизин декарбоксилазой, леван сахаразой, не гидролизуют желатину. Штамм не использует цитрат, ацетат и лактат натрия, мальтозу, сахарозу, арабинозу, глицерин.

Штамм чувствителен к ампициллину, тетрациклину, окситетрациклину, устойчив к стрептомицину, хлорамфениколу.

По совокупности признаков штамм идентифицирован как штамм вида Gluconobacter oxydans N В-7170 (Определитель Берги, 9 издание).

Сущность изобретения поясняется следующими конкретными примерами использования штамма Gluconobacter oxydans N В-7170.

Пример 1.

В примере 1 приведены данные, описывающие характер роста периодической культуры Gluconobacter oxydans N В-7170 в водной среде в условиях использования 2,4,5-Т в качестве источника углерода и энергии.

Посевной материал получают выращиванием штамма в пробирках в разбавленном мясо-пептонном бульоне (1МПБ:7Н₂O) при температуре +30^oC.

Полученный посевной материал засевают в количестве 0,01% от объема в жидкую солевую среду следующего состава: NH₄Cl - 1 г, К₂HPO₄ - 5 г, MgSO₄ • 7H₂O - 50 мг, FeSO₄ • 7H₂O - 5 мг, CuSO₄ - 1 мг, ZnSO₄ - 0,8 мг, 2,4,5-Т -100 мг на 1 литр, pH - 6,8-7,0. Инкубацию культуры проводят при +30^oC в течение 9 суток.

Культивирование проводят в термостатированных установках УВМТ-12-250 при 115-120 об/мин. Рост контролируют по изменению оптической плотности клеточной суспензии (ОД₅₉₀) с использованием фотоколориметра КФК-2 при длине волны 590 нм и чувствительности, равной 2. Результаты исследований показывают, что длительность лаг-фазы составляет примерно 1 сутки экспоненциальной фазы - около 3 суток, стационарной фазы - около 3 суток, затем происходит отмирание культуры.

Пример 2.

В примере 2 приведены результаты анализа динамики содержания 2,4,5-Т в культуральной жидкости штамма Gluconobacter oxydans N В-7170. Условия культивирования описаны в примере 1. Анализы проводят согласно методам определения микроколичеств пестицидов с небольшими модификациями (5). Для анализов отбирают по 10 мл культуральной жидкости на 3,5,7-е сутки инкубации штамма. Пробы освобождают от клеток штамма центрифугированием при 5 тыс.об. в мин. в течение 30 мин. Далее жидкость подкисляют до pH 2 добавлением нескольких капель 1 Н соляной кислоты. В каждую пробу добавляют в качестве стандарта 2,4-Д до конечной концентрации 100 мг/л. Затем из проб проводят 3-кратную экстракцию 2,4,5-Т и 2,4-Д равными объемами хлороформа. После экстракции хлороформ удаляют отгонкой на вакуумном" роторном испарителе. Экстракты 2,4,5-Т и 2,4-Д метилируют, переводят в гексан и фракционируют методом тонкослойной хроматографии. Тонкослойную хроматографию проводят на пластинах силуфол UV-254 (Чехия). Сканирование образцов проводят при длине волны 260-280 нм в камере Хромоскана (Jouce-Loebl). Для визуальной оценки результатов хроматографии пластины обрабатывают 0,001% раствором бромкредолового зеленого в 96% этаноле. Содержание 2,4,5-Т определяют по калибровочному графику для чистого стандарта 2,4-Д.

В таблице 1 представлены данные; демонстрирующие изменение содержания 2,4,5-Т в культуральной жидкости в зависимости от времени инкубации штамма.

Из данных таблицы 1 видно, что в течение 7 суток инкубации штамма происходит постепенное снижение концентрации 2,4,5-Т в культуральной среде. В течение 7 суток инкубации концентрация 2,4,5-Т снижается до 19,042%.

Пример 3.

В примере 3 приведены данные по идентификации продуктов деградации 2,4,5-Т, накапливаемых в водной среде в процессе культивирования штамма Gluconobacter oxydans N В-7170. Для анализа продуктов метаболизма отбирают пробы культуральной среды на 1,2,3,5,7-е сутки инкубации. Клетки бактерий из проб удаляют центрифугированием при 5 тыс.об. в мин. в течение 30 мин. Затем 2,4,5-Т и продукты деградации трижды экстрагируют равными объемами хлороформа и эфира. Хлороформ и эфир отгоняют на роторном вакуумном испарителе. Экстракты метилируют свежеприготовленным диазометаном, переводят в гексан. Затем объединяют по 0,2 мл полученных проб и объединенную пробу подвергают анализу. Анализ проводят на хромато-масс-спектрометре NERMAG R-30-10 с хроматографом Carlo Erba MEGA 5360. Условия определения: капиллярная колонка 15 м х 0,25 мм, привитая фаза ДВ-1, растворитель - гексан, температура инжектора +200^oC, интерфейса +250^oC, колонки от +80^oC до 250^oC, скорость нагрева 3,5 мин. Масс-спектры электронного удара получают при температуре источника ионов, равной +250^oC, энергии электронов, равной 70 эВ.

В таблице 2 представлен состав идентифицированных продуктов деградации 2,4,5-Т.

Из таблицы 2 видно, что в процессе культивирования штамма в культуральной жидкости не накапливается значительного количества производных феноксиуксусной кислоты и бензола.

Пример 4.

В примере 4 приведены данные, показывающие возможности использования штаммом Gluconobacter oxydans N В-7170 фенола, дихлорфенола, 4-хлорфеноксиуксусной кислоты, 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты в качестве единственного источника углерода и энергии. Посевную культуру штамма получают как описано в примере 1. Полученный посевной материал засевают в количестве 0,01% от объема в жидкую солевую среду следующего состава: NH₄Cl - 1 г, К₂HPO₄ - 5 г, MgSO₄ • 7H₂O - 50 мг, FeSO₄ • 7H₂O - 5 мг CuSO₄ • 5H₂O - 1 мг, ZnSO₄ - 0,8 мг на 1 литр, pH - 6,8-7,0. В качестве источника углерода и энергии в среды вносят раздельно фенол, 4-хлорфеноксиуксусную кислоту, 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту до конечной концентрации 100 мг/л. Инкубацию культур проводят в течение 7 суток в термостате ТС-80 при +30^oC.

В таблице 3 приведена оценка роста культуры Gluconobacter oxydans N В-7170.

Из данных таблицы 3 следует, что штамм Gluconobacter oxydans N В-7170 способен использовать в качестве источников углерода и энергии фенол, 4-хлорфеноксиуксусную кислоту, 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту.

Пример 5.

В примере 5 приведены результаты опытов по применению штамма Gluconobacter oxydans N В-7170 для биологической очистки почв, загрязненных 2,4,5-Т. Для исследований используют почву промзоны, в которой согласно анализам содержится 100 мг/кг 2,4,5-Т. Для проведения процесса биологической очистки в почву вносят посевной материал культуры из расчета 10⁵-10⁶ колониеобразующих единиц на 1 г почвы. Культивирование проводят при +24-27^oC в течение 21 суток. Через 1, 5, 10, 14, 21 сутки инкубации проводят отбор почвы в количестве 2 г. Пробы анализируют согласно методам анализа почв с модификациями (7). К каждой пробе добавляют по 10 мл дистиллированной воды. Пробы встряхивают 20 минут на качалке. Данную процедуру повторяют 3 раза. Водную вытяжку объединяют и осветляют центрифугированием при 5 тыс. об. в мин. в течение 30 мин. Далее жидкость подкисляют до pH 2 добавлением нескольких капель 1Н соляной кислоты. В каждую пробу добавляют в качестве стандарта 2,4-Д до конечной концентрации 100 мг/л. Затем из проб проводят 3-кратную экстракцию 2,4,5-Т и 2,4-Д равными объемами хлороформа. После экстракции хлороформ удаляют отгонкой на вакуумном роторном испарителе. Экстракты 2,4,5-Т и 2,4-Д метилируют, переводят в гексан и фракционируют методом тонкослойной хроматографии. Тонкослойную хроматографию и анализ содержания 2,4,5-Т проводят как описано в примере 2.

В таблице 4 представлены данные зависимости изменения содержания 2,4,5-Т от времени очистки почвы. Из таблицы 4 видно, что в почве происходит равномерное уменьшение 2,4,5-Т в течение 48 суток. Существенное изменение содержания 2,4,5-Т наблюдается после 10-14 дней обработки. К концу срока степень очистки достигает 66,5%.

Из данных таблицы 4 следует, что культура Gluconobacter oxydans N В-7170 активна в реальных условиях загрязненных почв. Степень очистки, достигаемая при использовании заявляемой культуры, составляет 27,4% на 21-е сутки, 31,9% на 30-е сутки и около 66,5% на 48-е сутки культивирования.

Преимущества штамма
Штамм Gluconobacter oxydans N В-7170 способен использовать 2,4,5-Т в качестве источника углерода и энергии в водной среде и почве. Эти свойства штамма определяют возможность использования данного штамма для очистки загрязненных жидких сред и почвы, если загрязнителем является 2,4,5-Т.

В результате использования штамма Gluconobacter oxydans N В-7170 деградация 2,4,5-Т в описанных условиях культивирования происходит без накопления существенного количества метаболитов, способных оказать токсическое действие на окружающую среду. Это означает, что с использованием штамма можно провести экологически безопасную очистку среды от 2,4,5-Т.

Штамм обладает полисубстратной активностью. Он может использовать в качестве источника углерода и энергии фенол, 4-хлорфеноксиуксусную кислоту, 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д).

Для штамма Gluconobacter oxydans N В-7170 установлен спектр чувствительности к антибиотикам. Эти особенности штамма могут быть использованы для тестирования штамма в окружающей среде.

Информация, принятая во внимание
1. Г.К.Скрябин, Л.А.Головлева. Использование микроорганизмов в органическом синтезе. Наука, М., 1976, 299-315.

2. Ю.Н.Карасевич. Основы селекции микроорганизмов, утилизирующих синтетические органические соединения. Наука, М., 1982, 64-141.

3. J. J. Kielbane, D. K. Chatterzee, A.Chakrabarty. // Detoxication of 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid from contaminated soil by Pseudomonas cepacia. // Applied and environmental microbiology, 1983, v.45, N 5, 1697-1700.

4. Л. А. Головлева, P.Н.Перцова, // Полное разложение и дехлорирование 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислоты штаммом Nocardiodis simplex 3Е. //Доклады АН СССР, вып.314, N 4, 981-983.

5. М.А.Клисенко (ред.) Методы определения микроколичеств пестицидов. Москва, Медицина, 1984, 201-219.

6. Е. З.Теппер, В.К.Шильникова, Г.И.Переверзева. Практикум по микробиологии. Москва, Агропромиздат, 1987, 147-205.

Изобретение относится к микробиологии синтетических органических соединений и касается микробиологического разрушения 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4,5-Т). 2,4,5-Т - экологически опасное соединение, обладающее токсичными и канцерогенными свойствами. Предложен новый штамм Gluconobacter oxydans, способный утилизировать 2,4,5-трихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4,5-Т). Штамм получен селекционным путем, имеет широкий температурный диапазон, pH 7 - 8. Способен производить микробиологическую деградацию 2,4,5-Т в жидкой солевой среде и почве с высокой эффективностью. 4 табл.

Штамм бактерий Gluconobacter Oxydans ВКПМ В-7170, осуществляющий биологическую деградацию 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислоты.