Способ получения рестриктаз Советский патент 1988 года по МПК C12N9/16 C12N1/20 C12N9/16 C12R1/01 

Изобретение относится к микробиологии, в частности к выделению и очистке рестриктаз, синтезируемых микроорганизмами,

Цельй) .изобретения является упрощение процесса выделения целевого продукта.

Способ заключается в следующем.

Клетки бактерий вносят в охлажденный буфер и подвергают дезинтеграции ультразвуком, доводя температуру (она повышается в процессе дезинтеграции) до 50-60 С, выдерживая при этой температуре 3-10 мин, затем экстракт освобождают центрифугированием от дебриса клеток, а надосадок используют для хроматографии. Полученные фракции исследуют на -наличие, фермента, объединяют и диализуют против 50%- ного раствора глицерина. Все стадии выделения фермента проводят при комнатной температуре.

Данный способ термообработки грубых клеточных экстрактов был апроби- рован для рестриктаз: Хва I, Хта .1, Нра 1,11, Hinf I, Hha I,. Нае 11,111, Bgl Up Ара I, Sau 96 I. Выделение рестриктаз после термоинактивации примесных ферментов на стадии получения грубого экстракта .клеток микроорганизмов позволяет исключить многостадийное фракционирование, ускорить процесс выделения, упростить его и повысить выход целевого продукта. Вследствие того, что примесные проте- олитические ферменты инактивируются на первой стадии и рестриктазы ими не гидролизуются на последующих стадиях, процесс выделения в дальнейшем можно проводить при комнатной температуре .

Оптимальными являются температуры 50-60°С, при которых происходит инактивация неспецифических ферментов в течение 3-10 мин, что позволяет проводить выделение указанных ферментов даже из биомасс микроорганизмов, содержащих большое количество неспецифических нуклеаз, -

Пример 1. Выделение рестриктазы Hha I.

1 ,.0 г влажных клеток бактерии Нае- .mophilus haemolyticus суспендируют в 4. мл 0,4 М NaCl в буфере А (10 мМ К-фосфатный буфер,рН 7;5; 10 мМ 2-меркаптаэтанол4,1 мМ Na - ЭДТА) с добавлением тритона Х-100 до . Смесь охлаждают до 6 С и подвергают

о 5 0

5 п

5

дезинтеграции ультразвуком на-дезинтеграторе MSE (Англия) с помощью конического стержня с диаметром нижнего конца 3 мм. Разрушение проводят при амплитуде 15 в течение 3 мин 15 с под контролем термометра до достижения 50 С, а затем охлаждают до

.

I .

Затем освобождаются от дебриса клеток центрифугированием при 18000 об/мин в течение 30 мин. Полученный экстракт разбавляют в 2 раза 0,01 М калийфосфатным буфером,рН 7,5, содержащим 10 мМ 2-меркаптоэтанола, . 1 мМ трилона Б, и наносят на колонку с фосфоцеллюлозой Р- 11 (Wathman), Элюцию сорбированных белков -проводят линейным градиентом NaCl в буфере А .Отбирают фракции объемом 0,8-0,9 мл и анализируют на содержание рестриктазы. Для этого 5 мкл каждой фракции вносят в 40 мл реакционной смеси, содержащей 1 мкг фага ламбда, 7,5 мМ трис-НС1,рН 7,5, 10 мМ 2-меркаптоэтанола, б MMMgSO, О, 1 М NaCl, Гидролиз пров.одят в течение 15 мин при 37°С. .Затем вносят 10 мкл смеси Б (додецил- сульфат натрия 0,2%, трилон Б 34%, сахароза 50%, бромфеноловый синий 0,025%). Пробы наносят на 1,4%-ный агарозный гель и проводят злектрофо- ,рез..

Фракции, содержащие фермент, объе- диняют. Активность фермента после хроматографии на фосфоцеллюлозе Р-11 в среднем составила 27 тыс.ед.акт./г биомассы, удельная активность -- 2400 ед.акт./мг.

Фермент не содержал существенных примесей.неспецифических нуклеаз и фосфатаз, как следовало из данных по длитель нрму (174) гидролизу ДНК фага Т7 и.тесту рестрикция - лигирование - рестрикция,

П р и М е р 2. Вьщеление рестриктазы Хва I.

г влажных клеток бактерии Хап- tomonas badrii суспендируют в 4 мл буфера (10 мМ трис-НС1, рН 7,9; 10 мМ 2-меркаптоэтанола) с добавлением до 0,1% тритона Х-100, охлажденного до , и подвергают дезинтеграции ульт-; развуком при частоте 20 кГц и ампли- туде 15 мкм до 55 С в течение 3 мин. Затем освобождаются от дебриса клеток путем центрифугирования при 18000 об/ /мин в течение 30 мин (12-21, фирма

Вес Icman) . Полученный экстракт разбавляют в 2 раза 0,01 М калийфосфат- ным буфером,рН 7,5, содержащим 10 мМ 2-меркаптоэтанола , 1 мМ -трилона Б, 10% глицерина (буфер А), и наносят на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой. Элюцию сорбированных белков проводят линейным градиентом КС1.Фермент элюируется КС1 при концентрации 0,3-0,5 М.. Отбирают фракции объемом 0,8-0,9 мл и анализируют на содержание рестрикта- зы Хва I. Для этого 5 мкл каждой фракции вносят в АО мкл реакционной смеси, содержащий 1 мкг ДНК Лага Т7. FMM трис-НС1,рН 7,9;6 мМ 2-меркаптоэтанола; 6 мМ MgClj. Гидролиз проводят в течение 15 мин при . Затем в . каждую пробу вносят 10 мкл смеси Б. Пробы наносят на 0,8%-ный агарозный гель и проводят электрофорез в 90 мМ трис-боратном буфере рН 8,3, содержащем 2,5 мМ трилона Б. Электрофорез ведут в течение 2 ч при силе тока 50 мА. Затем гели окрашивают этидиум- бромидом ,(5 мкг/мл) и просматривают в ультрафиолетовом свете. Фракции, содержащие рестриктазу, объединяют и диализуют в 50%-ном растворе глицерина, содержащем 10 мМ 2-меркаптоэтано-

ла, 1 мМ трилона Б. Активность полученного фермента Хва I из 1,0 г влажных клеток составляет 5000 ед. активности, что в 2 раза вьше,чем при получении известным способом. Хранится фермент при температуре -10 С. I П р и М е р 3. Выделение рестрик- |Тазы Хта I. (Xanthomonas malia сеа- rum) .

Вьщеление рестриктазы проводят, как указано в примере 1, за исключением того, что клетки разрушают без термообработки (на ледяной бане) при температуре не выше 10 С 5 раз по 45 с с интервалом 45 с с последующим их прогреванием 10 мин при 50°С на водяной бане. Активность полученного после фосфоцеллюлозы Р-11 фермента Хта I составила 200 ед.акт./г биомассы.

П р и М е р 4. Выделение рестриктазы Хта I.

Вьщеление проводят аналогично примеру 3, за исключением того, что клеки после разрушения не подвергали термообработке. Активность фермента составила 50 ед.акт./г биомассы.

П р и М е р 5. Вьщеление рестриктазы Нае II (Haemophilus aegyptius).

Выделение проводят, как указано в примере 1, за исключением того, что 1,0 г клеток разрушают 4 мин до дост тижения температуры экстракта 51°С. Активность фермента Нае II составила 2600 ед.акт./г биомассы. Фермент сохранил 50% активности через 9 мес хранения при температуре . П р и М е р 6. Выделение рестрик- тазы Hha I.

Выделение проводили аналогично примеру 1, за исключением того, что клетки в процессе разрушения и после него не подвергали термообработке. Фермент не выделен из- за большого количества неспецифических нуклеаз.

Пример 7. Вьщеление рестрик- тазы .Hinf I.

1,0 г влажных клеток бактерии Нае- mophilus influenzae В-2296 суспенди- руют в 4 мл буфера (10 мМ трис-НС1, рН 7,5; 10 мМ 2-меркаптоэтанола), ох лажденного до , и подвергают дег зинтеграции ультразвуком при частоте 20 кГц и амплитуде 15 мкм до достижения температуры 60 С и вьщерживают при ней в течение 5 мин.

Выделение проводят, как в примере 1. Активность полученного фермен

та Hinf I из 1,0 г влажных клеток составляет 10000 ед.активности, что почти в 70 раз выше получения известным способом. Фермент Ьсранится при

температуре .

Примере. Вьщеление рестриктазы Нае III.

Вьщеление проводят из 1 г клеток бактерии Haemophilus aegyptius В-2709,

как в примере 1. Термообработку проводят при 50°С 10 мин. Фермент элюируется раствором NaCl при концентрации 0, М. Активность вьщеленного фермента Нае III из 1,0 г влажных

клеток составляет 10000 ед.активности. Хранят фермент при температуре .

П р и М е р 9. Вьщеление рестриктазы Нра I, II.

Вьщеление проводят из 1,0 г клеток бактерии И. parainfluenzae, как в примере 1. Термообработку проводят при 10 мин. Фермент вьщелен не был из-за большого количества нёспецифических нуклеаз.

П р и М е р 10. Вьщеление рестрик- тазы Hinf I.

Вьщеление проводят, как в примере 1. Термообработку проводят при 65.С

5U061596

10 мин. Количество фермента, выделен- роорганизмов ультразвуком и освобож- ное в 1 г биомассы, снизилось,о чем дения от дебриса клеток центрифуги- свидетельстЪует наличие недорестрик- роианием, хроматографическую очистку ции субстрата в стандартных условиях g целевого фермента и диализ в 50%-ном определения активности.растворе глицерина, отлич ающ и и с я тем, что, с целью упроще-

Формул,а изобретения ния процесса выделения целевого продукта и повышения его активности,

Способ получения рестриктаз, вклю- 10 клетки при разрушении подвергают тер- чающий получение грубого экстракта мообработке при температуре от 50 до путем разрушения.исходных клеток мик- в течение от 3 до 10 мин.

Изобретение относится к биохимии и микробиологии, а именно к получению рестриктаз. С.целью упрощения процесса выделения целевого продукта и повьшения его активности исходные клетки микроорганизмов - продуцентов рестриктаз в процессе разрушения ультразвуком подвергают термообработке при температуре от 50 до бО с в течение от 3 до 10 мин, центрифугируют, а надосадок используют для дальнейшей хроматографической очистки целевого продукта при комнатной температуре. о (Л 4 о Од ел ;о