Способ иммунологической диагностики экзогенного аллергического альвеолита птицеводов Советский патент 1987 года по МПК G01N33/48 A61K39/00 

Изобретение относится к клинической иммунологии.

Цель изобретения - повьш1ение чувствительности способа, обеспечивающее увеличение эффективности иммунологической диагностики экзогенного аллергического альвеолита птицеводов.

Предлагаемый способ иммунологической диагностики экзогенного аллергического альвеолита птицеводов осуществляется путем выявления циркулирующих специфических птичьих антигенов (протеинов сыворотки кур) при добавлении к последовательным разведениям исследуемой сыворотки крови больного эритроцитарного диагностикума, полученного сенсибилизацией эритроцитов агрегированными белками иммунной сыворотки кролика. Для сенсибилизации используют агрегированную гамма-фракцию иммунной сыворотки, содержащую основную массу иммунологически активных белков-антител. Выделенную гамма-фракцию перед ее агрегацией глюта- 25 реиммунизации (для каждой инъекции) ральдегидом подвергают диализу против составляет 20 мг. Кровь забирают то- дистиллированной воды, физиологичес- тально через 7-10 дн„ после, последней

реиммунизации. TPITP иммунных сывороток в реакции диффузионной преципита- 30

кого раствора и разводят им в оптимальном соотношении 1:1 - 1:2 по объему.

Глутаризированные эритроциты сен- билизируют гамма-глобулином в течение 1-2 ч при 37-56°С. По агглютинации полученного эритроцитарного диагностикума в разведении исследуемой Сыворотки больного 1:64 и выше диагностируют заболевание экзогенным аллергическим альвеолитом,

Пример 1. Обработку эритроцитов человека (0(1) гр. Rh) глютар- альдегидом с целью их стабилизации и активации проводят по методу Л.Г.Гориной. Эритроциты человека 0(1)-й группы, резус-отрицательные много35

ции в пределах 1:32 - 1:64.

Пример 3. Выделение гамма- глобулина из иммунной сыворотки проводят двукратным осаждением сернокислым аммонием до 40%-ного насыщения Полученную гамма-фракцию иммунной сыворотки диализуют в течение суток против дистиллированной воды, а затем - против физиологического раствора хлористого натрия. Полученный та- д„ КИМ образом гамма-глобулин разливают небольшими объемами (1-2 мл) и до использования хранят при -20°С.

Пример 4. Подбор агрегирующей дозы глютаральдегида для иммункратно отмывают физиологическим раст- 45 - сыворотки осуществляют следующим вором хлористого натр-ия до отсутствия образом. К пробам, содержащим по 1 мл реакции на белок с 50%-ной трихлор- разведенного в 2 раза препарата гам- уксусной кислотой в надосадочной жидкости. К осадку отмытых эритроцитов

50

добавляют двукратный объем нейтрального физиологического раствора и глютаральдегид до конечной концентрации 0,25%. Обработку глютаральдегидом проводят при 37 С в течение 3 ч периодически перемешивая эритроцитарную 55 взвесь. Отмывают эритроциты 4 раза нейтральным (рН 7,0) физиологическим раствором, ресуспендируют им же осадок эритроцитов до 8%-ной концентрама-глобулина иммунной сыворотки (соотношение 1:2), добавляют в возрастающих дозах 2,5%-ный глютаральдегид (0,02; 0,03; 0,05; 0,07; 0,09 и 0,1 мл), инкубируют 1 ч при 37 ; С и оценивают эффект агрегации визуально. Проба с правильно выбранной дозой глютаральдегида не опалесцирует, слегка вязкая но свободно растекается. Для большинства полученных препаратов агрегирующая доза глютаральдегида составляет 0,02-0,05 мл.

ции, добавляют глютаральдегид до 0,25%-ной конечной концентрации и . мертиолат в соотношении 1:10000. Обработанные таким образом эритроциты стабилизированы, активированы и могут быть использованы при хранении при

,0

Ч С В течение 6 мес.

Пример 2. Получают иммунную

сыворотку путем иммунизации кроликов антигенным препаратом - куриной сывороткой. Схема иммунизации известна и состоит из 3 инъекций антигена: 1-я иммунизация - введение антигена в полном адъюванте Фрейнда непосредственно в лимфоузел; 2 и 3-я иммунизации - внутривенное введение антигена соответственно через 28 и 30 дн. после 1-й иммунизации. Иммунизирующие дозы

рассчитывают, исходя из концентраций общего белка в антигенном препарате (40 мг/мл), Для первой иммунизации доза антигена по белку составляет 5 мг на кролика. Концентрация белка при

реиммунизации. TPITP иммунных сывороток в реакции диффузионной преципита-

ции в пределах 1:32 - 1:64.

Пример 3. Выделение гамма- глобулина из иммунной сыворотки проводят двукратным осаждением сернокислым аммонием до 40%-ного насыщения. Полученную гамма-фракцию иммунной сыворотки диализуют в течение суток против дистиллированной воды, а затем - против физиологического раствора хлористого натрия. Полученный та- КИМ образом гамма-глобулин разливают небольшими объемами (1-2 мл) и до использования хранят при -20°С.

Пример 4. Подбор агрегирующей дозы глютаральдегида для иммун- сыворотки осуществляют следующим образом. К пробам, содержащим по 1 мл разведенного в 2 раза препарата гам-

ма-глобулина иммунной сыворотки (соотношение 1:2), добавляют в возрастающих дозах 2,5%-ный глютаральдегид (0,02; 0,03; 0,05; 0,07; 0,09 и 0,1 мл), инкубируют 1 ч при 37 ; С и оценивают эффект агрегации визуально. Проба с правильно выбранной дозой глютаральдегида не опалесцирует, слегка вязкая но свободно растекается. Для большинства полученных препаратов агрегирующая доза глютаральдегида составляет 0,02-0,05 мл.

- 1335877

Способ осуп;ествляют следующим образом.

1 мл обработанных глютаральдегидом эритроцитов отмывают 4 раза при 2000 об./мин 0,9%-ным раствором, добавляют к осадку отмытых эритроцитов 1 мл предварительно агрегированного гамма-глобулина иммунной сыворотки и 20 мг биокарбоната натрия. Сенсибилизацию эритроцитов проводят при 56°С в водяной бане в течение 1,5 ч. Отмывают сенсибилизированные эритроциты 4 раза физиологическим раствором хло10

Пример 5. Способ осуществляют по примеру 4, но применяют разведение гаммаглобулина 1:1 и сенсибилизируют эритроциты яри 37 С. Количество выявленных больных в исследованной группе составило 77%.

I

Таким образом, в результате осуществления способа чувствительность диагностики возросла на 31%. Следовательно, эффективность предлагаемого

способа при диагностике экзогенного аллергического альвеолита птицеводов ристого натрия. Ресуспендируют сенси- ,д значительно выше, чем известного спо- билизированные эритроциты до 0,8%-ной оба. Ни одна из исследованных сывоконцентрации и используют в качестве диагностикума, добавляют по 1 капле препарата (объем 0,025 мл).к каждому разведению исследуемых сывороток (в объеме 0,05 ш).

Исследуемые сыворотки предварительно для удаления гетерогемагглюти- нинов адсорбируют эритроцитами; обработанными глютарапьдегидом, но не сенсибилизированными. При осуществлении способа проводят несколько конт- ролей.

Эритроциты, не нагруженные антигеном, добавляют к исследуемой сыворотке в начальном разведении (контроль сыворотки на отсутствие гетеро- гемагглютининов). Сенсибилизированные гамма-глобулином иммунной сыворотки (антителами) эритроциты добавляют к физиологическому раствору (контроль диагностикума на наличие спонтанной гемагглютинации), Сенсибилизированные эритроциты добавляют к антигенному препарату (куриной сыворотке) в разведениях (контроль реакции).

Учет реакции проводят через 2 ч инкубации при комнатной температуре, считая положительной реакцию только в разведениях сыворотки, дающих выра- женную агглютинацию сенсибилизированных эритроцитов. Необходимыми условиями учета реакции являются отрицательные, контроли сыворотки и диагностикума, а также положительный контроль реакции.

Исследованные полученным диагнос- тикумом сыворотки больных в 77% случаев давали реакции в титре 1:64 и выше, тогда как сыворотки здоровых доноров давали реакцию не выше 1:32. По известному способу в исследованной группе опрэлтелено 46% больных.

Пример 5. Способ осуществляют по примеру 4, но применяют разведение гаммаглобулина 1:1 и сенсибилизируют эритроциты яри 37 С. Количество выявленных больных в исследованной группе составило 77%.

I

Таким образом, в результате осуществления способа чувствительность диагностики возросла на 31%. Следовательно, эффективность предлагаемого

роток с негативным результатом в пpeдлaгae ю : способе не была позитивной и в ргзвестном способе. Предлагаемый способ дает возможность выявления антигена - индуктора заболевания, верификации клинического диагноза и в случаях, когда результаты других имму1 ологических способов (выявления специфических антител) отрицательны. Применение предлагаемого способа имеет также большое значение для динамического наблюдения за контингентом лиц с профессиональным .риском заболевания экзогенным аллергическим альвеолитом.

I

Кроме того, предлагаемый способ имеет высокую производительность.За рабочий день можно провести исследование 80-100 сывороток крови. Это

позволяет использовать способ в качестве рутинного теста при массовых клинико-иммунологических обследованиях больших контингентов лиц, профессионально контактирующих с этиологическими факторами экзогенных аллергических альвеолитов.

Формула изобретения

5

Способ иммунологической диагностики экзогенного аллергического альвеолита птицеводов путем, исследования крови, отличающийся тем,

gQ что, с целью повышения чувствительности способа, перед исследованием крови из антисыворотки против белков куриной сыворотки выделяют гамма-гло булиновую фракцию, диализуют ее послеgg довательно против дистиллированной воды и физиологического раствора,разводят последним в соотношении 1:1 - 1:2 по объему, обрабатывают глутаро- вым альдегидом и сенсибилизируют глу .1335877б

таризированные эритроциты в течение гйммаглютинации в титре 1:64 и более ,1-2 ч при 37-56°С, далее добавляют их диагностирует аллергический альве- к исследуемой крови и при наличии олит.

Изобретение относится к клини- .ческой иммунологии. Для повышения. чувствительности способа к последовательным разведениям исследуемой сыворотки крови добавляют эритроцитар- ный диагностикум, полученный сенсибилизацией эритроцитов агрегированными белками иммунной сыворотки кролика. Для сенсибилизации используют агрегированную гамма-фракцию иммунной сыворотки. Вьщеленную гамма-фракцию перед агрегацией глутаральдегидом подвергают диализу против дистиллированной воды, физиологического раствора и разводят им в объемном соотношении 1:1-1:2. Глутаризированные эритроциты сенсибилизируют J -глобулином в течение 1-2 ч при 37-56 С, добавляют их к исследуемой крови и при наличии гемагглютинации в титре 1:64 и более диагностируют заболевание. с (Л 00 со ел 00 -sj