СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ДОБРОКАЧЕСТВЕННЫХ И ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ГЛИАЛЬНЫХ ОПУХОЛЕЙ Российский патент 2000 года по МПК G01N33/53 G01N33/50 

Изобретение относится к области медицины, а точнее к иммунодиагностике опухолей, и найдет применение в клинической практике для дифференциальной диагностики доброкачественных и злокачественных глиальных опухолей.

Глиальные опухоли составляют до 65% всех внутричерепных новообразований и отличаются инфильтрирующим характером роста, частым рецидивированием и озлокачествлением, а также плохим прогнозом (Бабчин И.С., Бабчина И.П. Клиника и диагностика опухолей головного и спинного мозга. 1973, с. 184). Более 5 лет после оперативного вмешательства проживает лишь каждый 4 больной, а в случае злокачественных глиом более одного года лишь 2-20% (Jellinger K. Опухоли головного мозга и их прогноз. Zentatbl Neurochir, 1978, т. 39, N 3, c. 285).

Требования современной нейрохирургии ориентированы не только на продолжительность жизни больного, но и на качество жизни. Поэтому при глубинных локализациях опухоли и расположении в функционально важных зонах, в зависимости от степени зрелости глиомы, возможен выбор в пользу консервативной терапии (Brock C.S. et al. Возможные перспективы в лечении глиом. Med. Oncol., 1997, т. 14, N 2, с. 113).

Однако установление степени анаплазии новообразования остается трудным вопросом. Клиническая диагностика гистроструктуры и биологических свойств опухоли, является лишь опосредованным предположением (Лихтерман Л.Б. Клиническая диагностика опухолей больших полушарий мозга. 1979). Традиционные методы диагностики (краниография, церебральная ангиография, пневмоэнцефалография) также малоинформативны. Современные методы томографии (компьютерная и магнитно-резонансная) определяют локализацию новообразования и в некоторых случаях могут дифференцировать глиальные опухоли от новообразований другого происхождения, не устанавливая степень злокачественности (Верещагин Н.В. Компьютерная томография и ее развитие в неврологии. 1985, с. 187; Холин А.В. Дифференциальная диагностика нейроэпителиальных опухолей и менингиом головного мозга с помощью МРТ. Журнал неврологии и психиатрии им. Корсакова, 1993, N 1, с. 67).

Таким образом, очевидна актуальность поисков информативных методов дифференциальной диагностики доброкачественных и злокачественных глиальных опухолей на дооперационном этапе. Использование уточненной диагностики определит прогностические суждения, а также позволит выбрать тактику и методы лечения, направленные на улучшение качества жизни больных.

Один из методов решения проблемы дифференциации доброкачественных и злокачественных глиом является применение иммунологических методов. Развитие опухолей головного мозга сопровождается изменением проницаемости гематоэнцефалического барьера, связанное с непосредственной деструкцией его структур, что влечет за собой развитие иммунных реакций, направленных против антигенов мозга и опухоли, а также элиминацией мозго- и опухолеспецифических веществ в кровь и ликвор (Bullard D.E. et al. Иммунобиология глиом. Sem in Oncology, т. 13, N 1, с. 97).

Проведенными исследованиями по патентной и научной литературе выявлен ряд способов дифференциальной диагностики доброкачественных и злокачественных глиальных опухолей, основанных на серологических методах исследования.

Так Kornblith P.L. et al. в статье "Цитотоксические антитела у пациентов с глиомами. Усовершенствованный метод" описывает способ обнаружения противоопухолевых антител в сыворотке больных с различными опухолями головного мозга в микроцитоксическом тесте с использованием линии клеток аллогенной глиобластомы (Neurosurg J. , 1979, т. 51, N 1, с. 47). Лисяным Н.И., Мамытовым М. М. в статье "Изменения иммунологических показателей у больных с опухолями головного мозга" излагается метод обнаружения противоопухолевых антител у больных с доброкачественными и злокачественными глиальными опухолями с помощью реакции связывания комплемента с соответствующими опухолевыми антигенами. (Журнал вопросы нейрохирургии имени Н.Н.Бурденко, 1985, с. 51). Yoshida J. с соавт. в статье "Обнаружение тенасцина в цереброспинальной жидкости для диагностики опухолей мозга" предлагает использовать для установления степени злокачественности глиальных опухолей определение концентрации тенасцина в спинно-мозговой жидкости (J. of neuroljgy, neurosurgery, and Psichiatry, 1994, N 57, с. 1214).

Но вышеуказанные способы обладают недостаточной диагностической чувствительностью, отсутствием высокой специфичности, сложной интерпретацией результатов и использованием дорогостоящих реактивов.

Прототипом данного изобретения является метод, описанный Р.Г.Биктимировым в диссертации кандидата медицинских наук "Роль комплексного иммуноферментного определения нейроспецифических белков в диагностике опухолей головного мозга" (1993). Метод основан на комплексном количественном анализе глиофибриллярного кислого протеина (GFAP), α2 гликопротеида (α2GP), α1- и α2-специфических глобулинов мозга (α1BG и α2BG) в сыворотке крови больных с помощью иммуноферментного метода.

Для определения α1BG и α2BG используют двухцентровый иммуноферментный анализ на основе колоночной иммуносорбционной хроматографии (ДИФАИХ). Исследуемую сыворотку (50 мкл) смешивают с 500 мкл разведенного конъюгата F(ab)2-фрагментов овечьих антител к α1BG или α2BG, которые получают путем иммунизации животных в течение 90 дней, с пероксидазой хрена в буфере, после инкубации смеси добавляют 100 мкл конъюгата овечьих F(ab)-фрагментов овечьих антител к α1BG или α2BG с кроличьим IgG, затем смесь наслаивают на колонку, наполненную сефарозой с иммобилизованными на ней F(ab)-фрагментами лошадиных антител к IgG кролика, после промывания и проявления ферментативной реакции колонки оптическую плотность элюата измеряют на сфектрофотометре Hitachi (Япония).

Для определения GFAP и α2GP используют твердофазный иммуноферментный анализ. После активирования полистироловых плат ("Dinateck" Швейцария и "Flow Laboratories" Англия) растворами специфических антител к GFAP и α2GP с последующим отмыванием инкубируют 0,2 мл исследуемой сыворотки, после повторного отмывания в ячейки вносят по 0,2 мл конъюгата вторичных антител с ферментом и после инкубации тщательно отмывают. Проявление ферментативной активности проводят раствором 5-аминосалициловой кислоты с перекисью водорода. Регистрацию результатов проводят на многоканальном фотометре "Titerec Multiskan" фирмы "Flow Laboratories" (Англия).

Этому способу свойственны следующие недостатки: длительность и нестандартность получения овечьих антител, использование дорогостоящих животных и реактивов, высокая вариабельность результатов, значительная трудность интерпретации результатов.

Целью настоящего изобретения является упрощение метода, сокращение сроков исследования, дорогостоящих материалов и трудоемкости.

Эта цель достигается исследованием сывороток в реакции пассивной гемагглютинации с доброкачественным, анапластическим и глиобластомным эритроцитарными диагностикумами с полиантигенными препаратами тканей соотвествующих новообразований, и при наличии положительных результатов с доброкачественным и анапластическим диагностикумом или только с доброкачественным диагностируют доброкачественные глиальные опухоли, при наличии положительных реакций со всеми тремя диагностикумами диагностируют злокачественные опухоли - анапластические глиомы, а при наличии положительных реакций с анапластическим и глиобластомным диагностикумами - злокачественные опухоли - глиобластомы.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СПОСОБА И ПРИМЕР ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
Исследуемую сыворотку адсорбируют формалинизированными эритроцитами барана в течение 1 часа при температуре 37^o, затем центрифугируют при 3 тыс. об/мин в течение 15 минут, надосадочную жидкость инактивируют на водяной бане в течение 30 минут при 56^oC. Затем сыворотку дополнительно адсорбируют эритроцитарным диагностикумом, содержащим антиген из нормальной ткани мозга, при температуре 37^o в течение 1 часа, соотношение сыворотки и диагностикума 1: 2. Из обработанной таким образом сыворотки готовят двухкратные разведения в объеме 0,05 мл в микротитраторе Такачи.

В каждую из лунок с разведенной сывороткой прибавляют по 0,025 мл опухолевого эритроцитарного диагностикума, пластины встряхивают и оставляют при комнатной температуре. Учет реакции производят через 3 часа. Титром сыворотки считают ее наибольшее разведение, которое дает положительную реакцию с эритроцитарным диагностикумом. При титре реакции более 1:8 реакцию считают положительной. Контролем специфичности РПГА служит реакция торможения пассивной гемагглютинации (РТПГА). В лунках микропластин Такачи готовят двухкратные разведения сыворотки в объеме 0,025 мл, добавляют 0,025 мл антигена в количестве 10-20 МНД и оставляют при 37^o на 1 час, по истечении указанного срока в каждую лунку добавляли эритроциты, сенсибилизированные аналогичным антигенным препаратом. После добавления эритроцитов пластины встряхивают и оставляют при комнатной температуре. Результаты реакции учитывают через 3 часа. Если активность испытуемой сыворотки подавлялась антигеном в 4-8 раз (2-3 лунки), то РТПГА считают положительной.

Для приготовления эритроцитарных диагностикумов используют формалинизированные эритроциты барана, полученные по методу Чизмеса в модификации Леви М. И. (1962), обработанные раствором танина в разведении 1:20000 в течение 30 минут при температуре 37^o. Отмытые от танина эритроциты сенсибилизируют антигенными препаратами, полученными из нормальной и опухолевой ткани мозга методом β-нафтоловой экстракции, изложенным в описании к патенту РФ N1623429 от 10.12.92, БИ N 3, 1995, МПК. К танизированным формалинизированным эритроцитам добавляют тканевой антиген из расчета 20 мкг антигена по белку на 1 мл эритроцитов; ставят на сенсибилизацию в термостат при 37^o на 40 минут, каждые 10 минут взбалтывают. Сенсибилизированные эритроциты трижды центрифугируют при 4000 об/мин в течение 10 минут в стандартно-солевом растворе, содержащем 0,85% хлорида натрия и 0,42% трехзамещенного цитрата натрия. Четвертый раз центрифугируют в смеси с бычьим сывороточным альбумином 0,27% концентрации, после чего добавляют формалин в количестве 1% к общему объему. Получают эритроцитарные диагностикумы с антигенными препаратами нормальной ткани мозга, а также полиантигенными комплексами ткани доброкачественных (фибриллярной, фибриллярно-протоплазматической, пилоцитарной астроцитом, олигодендроглиомы) и злокачественных глиом: анапластических (астроцитомы, олигоастроцитомы, эпендимомы) глиом, глиобластомы. Полиантигенные комплексы получают смешиванием антигенных препаратов ткани опухолей в равных количествах по белку. Использование полиантигенных препаратов необходимо, учитывая различия в антигенном составе глиальных опухолей отдельного гистологического происхождения.

Положительная реакция с эритроцитарными диагностикумами с доброкачественным и анапластическим полиантигенными комплексами или только с доброкачественным диагностикумом свидетельствует о наличии у больного доброкачественной опухоли. Положительная реакция с глиобластомным и анапластическим диагностикумами или только с глиобластомным свидетельствует о наличии у больного злокчаественной опухоли - глиобластомы. При положительных реакциях со всеми диагностикумами диагносцируют злокачественную анапластическую глиому.

С сывороткой крови здоровых доноров, пациентов с опухолями другого происхождения и локализации система диагностикумов не реагирует.

Описанный способ диагностики позволяет установить нейроэпителиальную природу новообразования в 98,9% наблюдений, а также точно распознать доброкачественные и злокачественные глиомы, а в группе злокачественных опухолей дифференцировать анапластические глиомы и глиобластомы.

Пример 1. Больной 3., 1988 г.р., находился в клинике нейрохирургии РГМУ с клиническим диагнозом: опухоль головного мозга. У больного до операции произвели забор крови. С полученной сывороткой ставили реакцию пассивной гемагглютинации (РПГА) с эритроцтарными диагностикумами с антигенами доброкачественных, анапластических глиом и глиобластом. Результаты представлены в таблице 1. Положительные ракции выявлены в РПГА с доброкачественным (в большем титре) и анапластическим диагностикумом, что свидетельствует о наличии доброкачественной глиальной опухоли, что впоследствии было подтверждено при оперативном вмешательстве и гистологическом исследовании. Гистологический диагноз после операции: фибриллярная астроцитома.

Пример 2. Больная Б., 1947 г.р., находилась в клинике нейрохирургии РГМУ с клиническим диагнозом: опухоль головного мозга. У больной до операции произвели забор крови, сыворотку исследовали в РПГА с панелью диагностикумов. Результаты приведены в таблице 1. Положительные результаты получены со всеми диагностикумами, что свидетельствует о наличии злокачественной опухоли - анапластической глиомы. Гистологический диагноз: анапластическая астроцитома совпал с диагнозом, поставленным до операции.

Пример 3. Больной М., 1939 г.р., находился в отделении ОКБ с клиническим диагнозом опухоль головного мозга. У больного до операции произвели забор крови, сыворотку исследовали в РПГА с панелью диагностикумов. Результаты приведены в таблице 1. Положительные реакции с анапластическим и глиобластомным эритроцитарными диагностикумами свидетельствуют о наличии у больного злокачественной опухоли - глиобластомы. Гистологический диагноз после операции: глиобластома.

Пример 4. При исследовании сыворотки крови здорового донора в РПГА отрицательные результаты получены со всеми диагностикумами, что свидетельствует об отсутствии глиальной опухоли.

На основании проведенных исследований выявлен ряд отличительных признаков предлагаемого способа по сравнению с прототипом, которые представлены в таблице 2.

Таким образом, как видно из приведенной таблицы 2, предлагаемый способ по сравнению с прототипом обладает следующими преимуществами: на 96 дней сокращается приготовление иммунных препаратов, на 15 время проведения анализа, лабораторные животные не используются, уменьшается в 14 раз стоимость, сокращается трудоемкость.

Изобретение относится к медицине, а точнее к иммунодиагностике опухолей, и найдет применение в клинической практике для дифференциальной диагностики доброкачественных и злокачественных глиальных опухолей для выбора оптимальной тактики и методов лечения, направленных на улучшение качества жизни больных. Способ обеспечивает упрощение метода, сокращение сроков исследования, дорогостоящих материалов и трудоемкости. Исследуют сыворотку больного в реакции пассивной гемагглютинации с доброкачественным, анапластическим и глиобластомным эритроцитарными диагностикумами с полиантигенными препаратами тканей соответствующих глиальных новообразований, и при наличии положительных результатов с доброкачественным и анапластическим диагностикумом или только с доброкачественным диагностируют доброкачественные глиальные опухоли, при наличии положительных реакций со всеми диагностикумами диагностируют злокачественные опухоли - анапластические глиомы, а при наличии положительных реакций с анапластическим и глиобластомным диагностикумами - злокачественные опухоли - глиобластомы. 2 табл.

Способ диагностики доброкачественных и злокачественных глиальных опухолей путем исследования сыворотки больного, отличающийся тем, что ставят реакцию пассивной гемагглютинации с доброкачественным, анапластическим и глиобластомным эритроцитарными диагностикумами с полиантигенными препаратами тканей соответствующих глиальных новообразований, и при наличии положительных результатов с доброкачественным и анапластическим диагностикумом или только с доброкачественным диагностируют доброкачественные глиальные опухоли, при наличии положительных реакций со всеми диагностикумами диагностируют злокачественные опухоли - анапластические глиомы, а при наличии положительных реакций с анапластическим и глиобластомным диагностикумами - злокачественные опухоли - глиобластомы.