СПОСОБ КОНТРОЛЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ ПОЛОСТИ РТА Российский патент 1997 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии, и предназначено для определения индивидуального уровня неспецифической резистентности организма к микробам, для оценки эффективности лечения ряда заболеваний полости рта (гингивитов, пародонтитов, стоматитов и др.), а также прогнозирования изменений уровня иммунитета до лечения.

В настоящее время в практической медицине с этой целью широко применяются, в частности различные способы оценки активности отдельных факторов слюны, участвующих в иммунитете, в том числе лизоцима (О.В.Бухарин, Н.В.Васильев, 1974), β-лизинов (J.D.Gebhard, 1982). Однако эти методики трудоемки, а для их проведения требуются дорогостоящие реактивы.

Прототипом предлагаемого способа является способ определения в слюне и сыворотки крови иммуноглобулинов A, G, M. Для этого обычно используют способ радиарной иммунодиффузии по Манчини (Шляхов Э.Н. Андриаш Л.П. Иммунология. Справочное пособие. Кишинев: Штинца, 1985, с.280). Но и эта методика также имеет ряд недостатков, касающихся трудоемкости и длительности получения результатов исследования, которые становятся известны лишь через 24 48 ч. Кроме этого, для проведения данного метода требуются дорогостоящие сыворотки, агары, специальные пластинки и камеры.

Общим недостатком всех известных способов определения активности факторов ротовой жидкости, участвующих в иммунитете, является то, что они не отражают антимикробной активности цельной слюны, ее клеточных и гуморальных факторов, участие которых в иммунитете общеизвестно.

Цель изобретения сокращение времени получения результатов, повышение точности способа и исследование неспецифической защиты организма от микробов путем использования факта взаимодействия слюны со взвесью микробов и, исходя из этого, последующего определения количества микробов (в млн.), фиксированных факторами слюны и осевших в осадок.

Для этого статус человека определяют по антимикробной активности слюны, используя взвесь микробов с тем, чтобы после соответствующих лабораторных манипуляций (центрифугирования, калориметрирования насадочной взвеси микробов и т.д.) подсчитать количество микробных тел (в млн.), фиксированных факторами слюны и осевших в осадок, и при величине антимикробной активности слюны менее 175 млн. микробных тел лечение считают эффективным.

Способ осуществляют следующим образом.

Для определения антимикробной активности слюны используют микробную взвесь, приготовленную из коммерческих, стандартизованных микробных препаратов диагностикумов или вакцин. В частности для определения антимикробной активности слюны, взятой у детей со "стоматологическими" заболеваниями, была использована взвесь микробов, приготовленная из диагностикума сальмонелл брюшного тифа (ТАШНИИВС).

Последовательность определения исходной оптической плотности названного диагностикума следующая. Взвесь встряхивают и центрифугируют в течение 10 мин при 1500 об/мин для получения осадка микробных конгломератов; при необходимости ее разводят физиологическим раствором. Затем определяют оптическую плотность микробов (в), используя калориметр КФК 2 3 с длиной волны 227 300 нм. Составляют шкалу, которая позволяет по оптической плотности микробов (в) определить количество микробных тел (в млн). Установлено, что содержание 750 млн. микроб. тел имеет 25,0% оптической плотности, соответственно 375 млн. 12,5% а 188 млн. 6,0% Следовательно, 1,0 оптической плотности соответствует содержанию около 25 млн. микроб. тел, т. е. эту величину получают путем деления цифры 750 млн. микроб. тел на их оптическую плотность 25%
Далее приводим сам способ определения количества микробов по их оптической плотности (в) с использованием калориметра КФО-2 с последующим вычислением млн. микробных тел.

Для этой цели 3 млрд взвеси микробов диагностикума, взятую в количестве 0,25 мл, последовательно разводят физиологическим раствором в 2 и 4 раза, а в контрольную пробирку добавляют 0,25 мл физиологического раствора. Затем в каждую пробу автоматическом дозатором А-2 добавляют по 2,00 мл физ. раствора; пробирки встряхивают и определяют в калориметре оптическую плотность микробов.

Далее к 0,10 0,25 мл взятой у больного слюны добавляют 0,25 мл приготовленной взвеси микробов, содержащей 300 750 млн. микроб. тел. Полученную таким образом смесь выдерживают в термостате в течение 20 30 мин при температуре 36 38^oC, центрифугируют 5 мин при 1500 об/мин, затем надосадочную жидкость с микробами, вступившими в контакт с факторами слюны, но не фиксированными ими, в количестве 0,25 мл переносят в заранее приготовленные пробирки, куда добавляют по 2,0 мл физ. раствора; последние встряхивают и в калориметре определяют (в) оптическую плотность микробов.

Подсчет производят следующим образом.

Из исходной оптической плотности микробов вычитают:
оптическую плотность надосадочных микробов;
оптическую плотность слюны, в которую вместо микробов добавляют 0,25 мл физ. раствора;
коэффициент поправки, отражающий количество микробов, которые выпадают в осадок в контрольных пробах без слюны.

Коэффициент поправки величина постоянная, она колеблется от 5 до 15% и зависит от методических параметров как самой микробной взвеси, так и способа центрифугирования. Получают величину антимикробной активности слюны в млн. и при ее величине 175 млн. микроб. тел лечение считают эффективным.

Сведения о возможности использования предлагаемого метода для контроля эффективности лечения "стоматологических" больных изложены в приведенных примерах.

Пример 1. Оценка эффективности лечения детей с хроническими воспалительными заболеваниями краевого пародонта, у которых местно применяли противовоспалительные средства (сок подорожника, мараславин, полиминерол).

Исследования проведены со смешанной слюной, взятой до лечения и после него, у 29 детей в возрасте 10 15 лет, имеющих хронический локализованный и генерализованный катаральный гингивит и хронический локализованный пародонтит.

Оказалось, что индивидуальные величины антимикробной активности смешанной слюны у детей колеблются от 25 до 273 млн. микробных тел. В связи с этим больные были разделены на две группы: к первой отнесли лиц с антимикробной активностью слюны от 25 до 175 млн. микробных тел, ко второй с величиной более 175 млн. (соответственно исходный уровень естественного иммунитета - низкий и высокий).

Подобное деление на группы выдержано в последующих примерах. Результаты приведены в табл.1.

Как видно из табл.1, среднее количество микроб. тел. блокированных смешанной слюной, у детей до начала их лечения составило 164±64, после лечения этот показатель снизился на 20 млн. (164 144 20). В то же время отмечается, что эффективность лечения зависит от исходного уровня антимикробной активности слюны. Так, у детей группы I с низкой исходной величиной этого показателя, как и прогнозировалось, выявилось статистически достоверное его повышение на 8 млн. (127 119 8), а у детей группы II - снижение на 50 млн. микроб. тел (220 170 50) при P ∠ 0,05.
Результаты исследования свидетельствуют о возможности использования заявленного способа для определения индивидуального уровня антимикробной активности слюны как объективного контроля не только за эффективностью лечения, но и прогнозирования его.

Пример 2. Оценка эффективности лечения детей с хроническими воспалительными заболеваниями краевого пародонта с использованием света гелий-неонового лазера в комплексе с медикаментами местного применения.

Исследование проводилось со смешанной слюной 14 детей в возрасте 10 15 лет с теми же заболеваниями, что и в первом примере, но в комплекс лечения была включена терапия светом гелий-неонового лазера. Результаты лечения представлены в табл. 2.

Как видно из табл.2, средняя величина антимикробной активности слюны до начала лечения составила 142±45 млн. микроб. тел (индивидуальные значения этого показателя колебались от 75 до 212). После лечения этот показатель достоверно повысился на 95 млн. микроб. тел (237 142 95) при P ∠ 0,01.. В то же время, у лиц группы I с исходной величиной показателя менее 175 млн. микроб. тел, как и предсказывалось, отмечается достоверное повышение этого показателя на 114 млн. микроб. тел (245 -131 114). У детей группы II отмечается склонность к снижению антимикробной активности слюны на 18 млн. микроб. тел (206 188 18).

Таким образом, результаты исследований полностью подтверждают выводы, изложенные в первом примере.

Пример 3. Оценка эффективности лечения детей с хроническими воспалительными заболеваниями краевого пародонта с использованием электрофореза c 10% -ным раствором хлористого кальция в комплексе с медикаментами местного применения.

Исследование проводилось со смешанной слюной семи детей в возрасте 10 - 15 лет с тем же заболеваниями, что и в предыдущих примерах, но в комплекс лечения был включен электрофорез с 10%-ным раствором хлористого кальция. Результаты представлены в табл.3.

Как видно из табл.3, средняя величина антимикробной активности слюны до начала лечения составила 238±45 млн. микроб. тел (индивидуальные значения колебались от 150 до 243). После лечения отмечается склонность к снижению антимикробной активности слюны на 16 млн. микроб. тел (238 212 16). В то же время, как и прогнозировалось, у лиц группы I отмечается повышение этого показателя на 106 млн. микроб. тел (369 163 106) и, наоборот, у лиц группы II с высоким исходным уровнем антимикробной активности слюны снижение его на 120 млн. микроб. тел (268 148 120).

Следовательно, результаты исследований, изложенные в этом примере, полностью подтверждают заключение предыдущих о возможности использования заявленного способа для определения индивидуального уровня неспецифической защиты организма от микробов, объективного контроля за эффективностью лечения и, главное, прогнозирование изменения индивидуального уровня антимикробной активности слюны еще до применения определенного вида терапии.

Таким образом, следует еще раз подчеркнуть, что способ контроля за эффективностью лечения "стоматологических" больных основан на определении антимикробной активности слюны с использованием тех коммерческих микробных диагностикумов, которые имеют высокую оптическую плотность (взвесь бактерий брюшного тифа). Основанием для использования именно этих сальмонелл послужил факт наличия высокой прямой корреляции между индивидуальными уровнями антимикробной активности слюны у детей и к шигеллам Зонне, Ньюкастла, Флекснера, имеющим также высокую оптическую плотность. Таким образом, у лиц с низким исходным уровнем антимикробной активности слюны к микробам брюшного тифа отмечается такая же величина этого показателя и к другим вышеперечисленным микробам, а у лиц с высоким уровнем антимикробной активности слюны к этим же микробам отмечается высокий показатель величины.

Приведенные результаты исследования убедительно свидетельствуют о значительных преимуществах заявляемого способа в сравнении с прототипом, заключающимся прежде всего в том, что первый отражает антимикробную активность цельной слюны и позволяет одномоментно оценить ее факторы, участвующие в иммунитете, по их способности агглютинировать, фиксировать, блокировать микробы и переводить их в осадок.

Заявляемый способ отличается также простотой исполнения и экспрессностью: при серийных исследованиях для определения антимикробной активности слюны одного человека требуется не более 5 10 мин, причем результаты выдаются сразу, в то время как для определения концентрации иммуноглобулинов необходимо не менее 24 -48 ч.

Кроме этого, другим преимуществом заявляемого способа является высокая экономичность, ибо в данном случае для определения антимикробной активности слюны не требуются дорогостоящие сыворотки, реактивы, агары и т.д. В частности этот способ позволяет также выявить состояние иммунодефицита, с одной стороны, а с другой стороны, он является безопасным методом в вопросах возможности заражения СПИДом, так как исключен контакт с кровью персонала при проведении лабораторных исследований, а также при заборе слюны у больных.

Использование: медицина, иммунология, для определения индивидуального уровня неспецифической резистивности организма к микробам, для оценки эффективности лечения ряда заболеваний полости рта (гингивитов, пародонтитов, стоматитов и др.). Задача: сокращение времени получения результатов, повышение точности способа, исследование неспецифической защиты организма от микробов. Сущность изобретения: способ заключается в определении антимикробной активности слюны путем ее обработки со взвесью микробов, центрифугирования, калориметрирования надосадочной взвеси микробов. Затем определяют количество микробов, которые фиксированы факторами слюны и выпадают в осадок, и при исходной величине антимикробной активности слюны менее 175 млн микробных тел лечение считают эффективным. 3 табл.

Способ контроля эффективности лечения заболеваний полости рта путем исследования слюны, отличающийся тем, что слюну обрабатывают со взвесью микробов, центрифугируют, калориметрируют надосадочную взвесь микробов, затем определяют количество микробов, которые фиксированы факторами слюны и выпадают в осадок, и при исходной величине антимикробной активности слюны менее 175 млн микробных тел лечение считают эффективным.