СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ ЗАЩИТЫ ОРГАНИЗМА ОТ МИКРОБОВ Российский патент 2001 года по МПК G01N33/569 G01N33/556 

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии, и предназначено для определения индивидуального уровня неспецифической защиты организма от микробов, для оценки эффективности лечения ряда заболеваний органа зрения (кератиты, склериты, увеиты и др.), а также контроля и прогнозирования изменения уровня неспецифической защиты организма под влиянием лечения. В настоящее время в практической медицине оценка величины неспецифической защиты организма (НЗО), как правило, проводится путем выделения из крови и исследования активности или количества отдельных клеточных и гуморальных факторов иммунитета (Шляхов Э.Н., Андриеш Л.П. Иммунология: Справочное пособие. - Кишинев, 1985. - 280 с.). Однако большинство этих способов отличаются сложностью и трудоемкостью. При проведении этих исследований требуются дорогостоящие, дефицитные реактивы и сложная аппаратура. Забор крови представляет определенную опасность как для обследуемого, так и для медицинского персонала в связи с распространением среди населения различных инфекций, в том числе СПИДа. Вышеперечисленные недостатки ограничивают применение данных способов для оценки неспецифической защиты организма.

В медицине с этой же целью применяются различные способы оценки активности или количества факторов слезной жидкости, участвующих в иммунитете, в том числе β-лизина (Стукалов С.Е. Иммунологические исследования в офтальмологии. - Воронеж, 1975. - 224 с. ); иммуноглобулинов класса А, М, G, (Пучковская Н. А. , Шульгина Н. С. , Минев М.Г., Игнатов Р.К. Иммунология глазной патологии. - М.: Медицина, 1983.-208 с.).

Однако эти методики трудоемки, а для проведения исследований требуются дорогостоящие реактивы.

В литературе имеются работы, в которых установлена возможность использования реакции пассивной гемагглютинации для характеристики процессов аутоиммунитета (Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник. Под ред. В.В. Меньшикова, М.: Медицина, 1987.- 368 с.).

Однако для определения величины неспецифической защиты организма от микробов этот метод не применяется.

Прототипом предлагаемого способа является метод определения в слезной жидкости, слюне и сыворотке крови иммуноглобулинов класса A, M, G. Для этого обычно используется способ радиарной иммунодиффузии по Манчини (Шляхов Э.Н. Андриеш Л.П. Иммунология: Справочное пособие. - Кишинев, 1985, - 280 с.). Но и эта методика также имеет ряд недостатков, касающихся трудоемкости получения результатов исследования. Кроме этого, для проведения исследований с использованием данного метода требуются дорогостоящие сыворотки, агары, специальные пластинки и камеры.

Изобретение направлено на решение задачи: упрощение, повышение экономичности и безопасности исследования величины неспецифической защиты организма от микробов.

Сущность способа. Решение данной задачи достигается путем определения титра антител (ТА) в слезной жидкости в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) к дизентерийной группе микробов, и при величине титра антител 64 и ниже величину неспецифической защиты организма от микробов считают низкой.

Новизна способа заключается в том, что впервые величину неспецифической защиты организма от микробов определяют по титрам антител в слезной жидкости с использованием РПГА к дизентерийной группе микробов и при величине титра антител 64 и ниже величину неспецифической защиты организма от микробов считают низкой.

Способ осуществляют следующим образом. У обследуемого проводят забор слезной жидкости в количестве от 0,125 до 0,5 мл в пробирку. Затем слезную жидкость дозатором переносят в лунку первого ряда планшета для макроварианта постановки РПГА в количестве от 0,125 до 0,5 мл и путем добавления физиологического раствора в объеме от 0,0 до 0,385 мл доводят объем раствора слезы до 0,5 мл в 1-й лунке. В лунки первого ряда и последующих рядов приливают по 0,5 мл физиологического раствора и раститровывают слезную жидкость каждой пробы по горизонтали так, чтобы в первой лунке ее разведение было двухкратное, во второй - четырехкратное и т.д. до 10 - 12 ряда лунок планшета. В последующем в каждую лунку добавляют по 0,2 - 0,25 мл 1% взвеси эритроцитов антигенного диагностикума из шигелл Зонне, Ньюкестл или Флекснера. Для этой цели 1,0 мл сухого антигенного эритроцитарного диагностикума разводят в 10 мл физиологического раствора. Планшеты осторожно встряхивают и выдерживают при температуре 10 - 20^oC в течение 18-24 часов, затем оценивают результаты.

Учет реакции проводят по 4-х крестной системе:
4+ - все эритроциты были агглютинированы и равномерно покрывали дно лунок;
3+ - агглютинированы почти все эритроциты, но на фоне их имелось мало заметное кольцо из осевших неагглютинированных;
2+ - одновременно с равномерным агглютинатом на дне лунок имелся осадок из неагглютинированных эритроцитов в виде маленького колечка;
1+ - большинство эритроцитов не было агглютинировано и осело в виде маленького колечка в центре лунки;
0+ - все эритроциты не были агглютинированы и осели в виде колечка в центре лунки.

Величиной ТА слезной жидкости считают максимальное ее разведение, в котором гемагглютинация оценивается не менее чем на три креста.

Результаты о возможности использования предлагаемого метода для определения индивидуальной и групповой величины неспецифической защиты организма, для контроля эффективности лечения больных с заболеваниями органа зрения изложены в приведенных примерах.

Пример 1. Величина неспецифической защиты организма от микробов у больных с различными формами глазной патологии.

Для этого все больные разделены на три группы: первая группа - 36 человек с механическими травмами органа зрения (проникающие и непроникающие ранения, контузии средней и тяжелой степени глазного яблока); вторая группа - 43 человека с воспалительными заболеваниями склеры, роговицы, сосудистого тракта различной этиологии; третья группа - 20 человек с заболеваниями глаз невоспалительного характера (глаукома, катаракта, дистрофии тканей глаза). Контролем служили результаты исследований ТА слезной жидкости, проведенные у 26 офтальмологически здоровых мужчин и женщин в возрасте от 21 до 62 лет.

Результаты исследований представлены в табл. 1.

Как видно из табл. 1, наибольшая величина титра антител в слезной жидкости определяется у больных с воспалительными заболеваниями и составляет 284, индивидуальные показатели колеблются от 2 до 2048. Из 43 больных этой группы низкая исходная величина неспецифической защиты организма определяется у 24 обследуемых: ТА равняется 64 и ниже, а у 19 больных отмечается высокая исходная ее величина: ТА составляют 128 и выше.

У больных с невоспалительными заболеваниями органа зрения средняя исходная величина ТА равняется 270, индивидуальные показатели колеблются от 8 до 2048. При этом из 20 больных у 11 - величина ТА составляет 64 и ниже, а у 9 - 128 и выше. Наименьшая величина титра антител определяется у больных с механическими травмами и составляет 120, индивидуальные его показатели - от 2 до 2048. Из 36 обследованных - у 26 определяется низкая величина ТА: соответственно равняется 64 и ниже, а у 11 больных - 128 и выше.

Как видно из табл. 1, у обследованных контрольной группы средняя исходная величина ТА равняется 28, индивидуальные показатели колеблются от 4 до 128.

Результаты этих исследований свидетельствуют о том, что средняя величина ТА в слезной жидкости в контроле значительно ниже по сравнению с соответствующей величиной у больных с травмами и заболеваниями органа зрения. Эти данные указывают на то, что любая патология органа зрения является причиной изменения величины титра антител в слезной жидкости.

Таким образом, результаты, представленные в примере 1, подтверждают возможность использования предлагаемого способа для оценки индивидуальной и групповой величины неспецифической защиты организма от микробов у больных с различной патологией органа зрения.

Пример 2. Зависимость между величинами ТА в слезной жидкости и в сыворотке крови у больных с глазной патологией.

Для этого одновременно проводили исследования слезной жидкости и сыворотки крови у 32 больных с различными формами глазной патологии по вышеуказанной методике с использованием РПГА к дизентерийной группе микробов.

Результаты отражены в табл. 2.

Из табл. 2 следует, что средняя величина ТА в слезной жидкости у всех обследуемых составляет 209, индивидуальные его показатели колеблются от 8 до 2048, в сыворотке крови средняя величина ТА ниже и соответственно равняется 98, индивидуальные его колебания от 4 до 2048. Всех обследуемых больных по возрастанию индивидуальной величины ТА в слезной жидкости разделили на четыре группы. К I группе отнесли 8 человек с величиной ТА до 16, ко II - 11 человек, с величиной ТА до 64, к III - 8 человек с величиной ТА до 256 и к IV - 5 человек с величиной ТА, равной 512 и более. При этом, несмотря на существенные колебания концентрации гуморальных факторов в слезной жидкости и сыворотке крови, наблюдается прямая корреляционная связь между средними величинами ТА четырех подгрупп обследуемых (r = +1,00±0,00; p < 0,001).

Следовательно, данные примера 2 свидетельствуют о том, что заявляемый способ отражает как уровень местного иммунитета в слезной жидкости у больных с заболеваниями органа зрения, так и величину НЗО от микробов в целом.

Пример 3. Зависимость ТА слезной жидкости в РПГА от иммуноглобулинов в сыворотке крови у больных с глазной патологией.

Для установления связи между величиной ТА в слезной жидкости и концентрацией иммуноглобулинов класса G, A, M в сыворотке крови использовали способ определения иммуноглобулинов методом радиарной иммунодиффузии по Манчини у 27 больных с заболеваниями органа зрения.

Результаты исследований представлены в табл. 3.

Как видно из табл. 3, наблюдается прямая корреляционная связь между средними величинами ТА в слезной жидкости и концентрацией иммуноглобулинов класса М в сыворотке крови (r = +1,00±0,00; p < 0,001). В то же время определяется тенденция к обратной корреляции между средними величинами ТА в слезной жидкости и концентрацией иммуноглобулинов класса А (r = -0,8±0,2; p > 0,05). Таким образом, полученные результаты доказывают возможность использования изучаемого способа для определения НЗО от микробов в слезной жидкости у больных с заболеваниями органа зрения независимо от определения гуморальных факторов иммунитета в сыворотке крови.

Пример 4. Динамика изменения величины неспецифической защиты организма от микробов у больных с воспалительными заболеваниями глазного яблока под влиянием лечения.

Исследования проводили со слезной жидкостью, взятой в течение первых трех суток поступления в стационар и после окончания курса лечения при выписке из стационара (через 2-3 недели) у 16 больных, страдающих воспалительными заболеваниями глазного яблока (кератиты, склериты, увеиты различной этиологии).

Результаты отражены в табл.4.

Из табл. 4 следует, что средняя исходная величина ТА у обследуемых составила 352, а индивидуальные показания колеблются от 4 до 1024. С учетом динамики изменения ТА под влиянием лечения всех больных разделили на две группы: к первой отнесли лиц с низкой величиной ТА, равной 64 и менее; ко второй - равной 128 и более. После лечения отмечается снижение средней величины ТА с 352 до 257.

Однако определяется обратная зависимость между исходной величиной ТА и уровнем ее изменения. У обследованных первой группы с величиной ТА, равной 64 и ниже, после лечения определяется статистически достоверное (p < 0,05) повышение показателя неспецифической защиты с 31 до 157 (+406% к фону), а у больных второй группы с высокой исходной величиной, равной 256 и более, наблюдается снижение ее уровня с 672 до 356 (-47% к фону).

Следовательно, данные примера 4 подтверждают возможность использования заявляемого способа как для определения индивидуальной величины НЗО организма, так и контроля и прогнозирования эффективности лечения. Результаты исследований, изложенные в примере, убедительно подтверждают обоснованность деления больных на две группы по исходной величине ТА в слезной жидкости. Именно у больных первой группы с низкой исходной величиной ТА, равной 64 и ниже, наблюдается существенное повышение ее уровня под влиянием лечения.

Приведенные выше данные свидетельствуют о значительных преимуществах предлагаемого способа в сравнении с прототипом, заключающихся прежде всего в том, что заявляемый способ отличается простотой использования, высокой точностью, экономичностью и безопасностью для обследуемых лиц.

Простота исполнения связана с тем, что в серийных исследованиях слезной жидкости для определения титра антител в реакции пассивной гемагглютинации требуется не более 5 - 7 минут.

Высокая точность исследования: процент ошибки в различных сериях опытов составляет 1-3%, стопроцентная воспроизводимость способа связана с тем, что титр антител в слезной жидкости определяется в реакции пассивной гемагглютинации с использованием коммерческих антигенных эритроцитарных диагностикумов.

Экономичность способа основана на том, что для исследований не требуются стерильная посуда и инструменты для взятия крови, а также дорогостоящие дефицитные препараты, сыворотки к иммуноглобулинам, агары и стерильные условия для постановки опытов.

Дополнительным преимуществом заявляемого способа является его безопасность для обследуемых лиц, что является очень важным в связи с широким распространением инфекций среди населения, таких как вирусный гепатит, венерические заболевания, СПИД и других.

С учетом вышеизложенного предлагаемый способ можно рекомендовать для широкого использования при исследовании индивидуальной и групповой величины неспецифической защиты организма от микробов, определения иммунодефицитных состояний, контроля и прогнозирования эффективности лечебно-оздоровительных мероприятий, отбора больных для лечения средствами, повышающими резистентность организма к микробам, а также в других областях медицины.

Изобретение относится к медицине в частности к иммунологии, и предназначено для определения индивидуального уровня неспецифической защиты организма от микробов, для оценки эффективности лечения ряда заболеваний органов зрения (кератиты, склериты, увеиты и др.), а также контроля и прогнозирования изменений уровня защиты под влиянием лечения. Оценку неспецифической защиты организма от микробов проводят в слезной жидкости в реакции пассивной гемагглютинации к дизентерийной группе микробов и при величине титра антител, равной 64 и ниже, величину неспецифической защиты организма от микробов считают низкой. Способ прост в исполнении, точен в исследованиях, исключает применение дорогостоящих дефицитных препаратов. 4 табл.

Способ определения неспецифической защиты организма от микробов путем исследования слезной жидкости, отличающийся тем, что оценку неспецифической защиты организма от микробов проводят по титрам антител в слезной жидкости в реакции пассивной гемагглютинации к дизентерийной группе микробов и при величине титра антител, равной 64 и ниже, величину неспецифической защиты организма от микробов считают низкой.