СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ЭССЕНЦИАЛЬНОЙ ГИПЕРТЕНЗИИ И СИМПТОМАТИЧЕСКОЙ НЕФРОГЕННОЙ АРТЕРИАЛЬНОЙ ГИПЕРТЕНЗИИ Российский патент 1997 года по МПК G01N33/92 

Изобретение относится к разделу медицины, а именно к биохимической лабораторной диагностике в клинической кардиологии.

Мембранная концепция возникновения и развития эссенциальной гипертензии (ЭГ) (Постнов Ю.В. Кардиология. 1985. N 10. С. 63-71.) получила большое распространение как у нас в стране, так и за рубежом. Одним из основополагающих постулатов этой концепции является существование генетически обусловленных маркеров мембранных нарушений. Наличие таких маркеров продемонстрировано в миоцитах, адипоцитах, тромбоцитах, лимфоцитах и эритроцитах (Постнов Ю. В. Орлов С. Н. Первичная гипертензия как патология клеточных мембран. М. Медицина, 1987. 192 с.). Эти маркеры проявляются изменениями клеточных мембран, которые затрагивают трансмембранный транспорт ионов. Физико-химическое состояние липидного бислоя мембран, структуру мембранных белков и активность связанных с мембраной ферментов. В клинической практике лишь только в последние годы осуществляются попытки использования некоторых биохимических методов, дающих оценку структурно-функциональным изменениям клеточных мембран для дифференциальной диагностики артериальных гипертензий (эсенциальной и симптоматических).

Для дифференциальной диагностики ЭГ и симптоматических артериальных гипертензий по мембранным нарушениям предложено в настоящее время несколько способов. Одним из них является определение Na-Li-обмена (Постнов Ю.В. и др.

Кардиология. 1985. N4. С. 52-55), что позволяет дать оценку проницаемости эритроцитарной мембраны для ионов натрия. Этот метод несмотря на свою трудоемкость дает хорошие результаты при дифференциальной диагностике артериальных гипертензий. Результаты исследования Na-Li-обмена позволяют получить информацию о функциональном состоянии мембраны у больных с артериальной гипертензией.

Другой способ дифференциальной диагностики ЭГ по мембранным нарушениям основан на использовании иммунохимических методов (Логинов В.А. и др. А.с. 4216427, СССР). Этот способ основан на различном связывании определенного класса моноклональных антител, полученных к кальций-аккумулирующим мембранам сердечной мышцы собаки, с эритроцитарными мембранами больных ЭГ и симптоматическими артериальными гипертензиями. Иммунохимический метод в отличии от Na-Li-обмена позволяет делать вывод о структурном состоянии мембран при артериальных гипертензиях. Этот метод достаточно чувствителен при сопоставлении больных ЭГ и симптоматическими (почечными) артериальными гипертензиями, однако по специальности он уступает способу дифференциальной диагностики артериальных гипертензий по Na-Li-обмену (Логинов В.А. - Тер.архив. 1989. N12. С.27-29). Тем не менее эти мембранные методы дифференциальной диагностики ЭГ до сих пор не нашли широкого практического применения в силу их сложности, трудоемкости и доступности используемой импортной аппаратуры лишь узкопрофильным научным центрам. Поэтому в последние годы был предложен еще один способ дифференциальной диагностики ЭГ, основанный на определении отношения общих липидов эритроцитарных мембран к уровню продуктов перекисного окисления липидов мембран эритроцитов (Кулагин Ю.И. и др. А.с. 1527586, СССР) "Способ дифференциальной диагностики гипертонической болезни и артериальной гипертензии, обусловленной хроническим пиелонефритом". Этот способ взят в качестве прототипа. В его основе лежит определение общих липидов в мембранах эритроцитов, выделенных из периферической крови, и определение уровня продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ суммы диеновых конъюгатов и диеновых кетонов. Диагностический коэффициент (ДК) рассчитывают по отношению липидов мембран (Л_м) к уровню ПОЛ мембран (ПОЛ_м) по формуле:

В среднем для ЭГ ДК=27,82±0,68; для хронического пиелонефрита с симптоматической гипертензией ДК=51,23±1,31.

Метод этот достаточно прост и доступен практически любой клинико-биохимической лаборатории. Однако он имеет ряд существенных недостатков. Во-1-х, изменение уровня продуктов ПОЛ в мембранах эритроцитов, как это доказано в результате многочисленных исследований последнего десятилетия, происходит практически при любой патологии внутренних органов. Процессы свободно-радикального окисления липидов в клеточных мембранах - универсальная общебиологическая реакция организма как на экзо-так и на эндогенные воздействия. Любые колебания атмосферного давления, уровня естественного радиоактивного фонового излучения, изменение пищевого рациона и многие другие факторы способны влиять на содержание ПОЛ в мембранах эритроцитов, что негативно сказывается на результатах дифференциально-диагностической значимости рассматриваемого способа диагностики. Во-2-х, другой показатель, взятый авторами прототипного способа - это общие липиды мембран эритроцитов. Данный показатель вообще является неспецифическим и малоинформативным в силу того, что при таких нозологических формах, как гипертоническая болезнь и хронический пиелонефрит, а также сахарный диабет, ишемическая болезнь сердца, хронический бронхит и других меняется в основном соотношении отдельных фракций фосфолипидов (содержание одних фракций снижается, других, наоборот, повышается) и уровень холестерина. Концентрация же общих липидов остается практически без изменений. И, в 3-х, сама эритроцитарная мембрана, являясь универсальной моделью мембранологии, не в полной мере отражает специфику происходящих в организме в том или ином случае патологических сдвигов.

Поэтому с целью повышения точности и информативности мембранных тестов и упрощения дифференциальной диагностики артериальных гипертензий различного генеза за счет исключения использования дорогостоящего оборудования и небезопасных для пациентов методов обследования (радионуклеидные методы дифференциальной диагностики, прямая нефроангиография с введением катетера в аорту через бедренную артерию и контрастированием почечных сосудов с помощью высокоаллергогенных препаратов и достаточно большой лучевой нагрузкой), основанный на выделении нейтрофилов и определении в их мембранах строго определенных фракций фосфолипидов, а именно лизофосфатидилхолина (ЛФХ), сфингомиелина (СМ), фосфатидиэтаноламина (ФЭА), а также содержания холестерина (Х_л) у больных ЭГ и симптоматической нефрогенной артериальной гипертензией.

Указанная цель достигается тем, что в способе дифференциальной диагностики ЭГ и симптоматической нефрогенной артериальной гипертензии, заключающимся в заборе крови, выявлении нейтрофилов, из мембран которых экстрагируют липиды и получают липидные экстракты, определяют количество липидов по их оптической плотности и вычисляют диагностический коэффициент. Согласно изобретению в мембранах нейтрофилов определяют содержание фракций фосфолипидов лизофосфатидилхолина (ЛФХ), сфингомиелина (СМ) и фосфатидилэтаноламина (ФЭА) и уровень холестерина (Х_л) про их оптической плотности при длине волны для фосфолипидов 655 нм и 650 нм для холестерина, определяют диагностический коэффициент (ДК) по формуле:

и при значении ДК от 1,0 до 1,8 диагносцируют эссенциальную гипертензию, а при значении ДК от 2,0 до 2,8 диагностируют симптоматическую артериальную гипертензию на фоне хронического пиелонефрита.

Изобретение отличается от прототипа тем, что в мембранах нейтрофилов по оптической плотности и при длине волны 655 нм определяют содержание фракций фосфолипидов лизофосфатидилхолина (ЛФХ) и фосфатидилэтаноламина (ФЭА). По оптической плотности и при длине волны 650 нм определяют уровень холестерина и после этого рассчитывают диагностический коэффициент (ДК) по формуле:

и при значении ДК 1,0-1,8 диагносцируют эссенциальную гипертензию, а при значении ДК 2,0-2,8 диагносцируют симптоматическую артериальную гипертензию.

Эти отличия позволяют сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию "новизна".

Признаки, отличающие заявляемое техническое решение от прототипа, не выявлены в других технических решениях при изучении данной и смежной областей медицины и, следовательно, обеспечивают заявляемому решению соответствие критерию "изобретательский уровень".

При использовании предлагаемого метода получены достоверные дифференциально-диагностические критерии отличий ЭГ от симптоматической нефрогенной гипертензии на мембранном уровне в виде менее значительного повышения ЛФХ при ЭГ и более значительного при симптоматической гипертензии; выраженного повышения содержания СМ при ЭГ и, наоборот, снижения при симптоматической гипертензии; уменьшения уровня ФЭА при ЭГ и, наоборот, повышения при симптоматической гипертензии; и более выраженного увеличения содержания холестерина при ЭГ по сравнению с симптоматической гипертензией.

Суть метода состоит в следующем. В отличие от всех известных способов дифференциальной диагностики ЭГ и симптоматических артериальных гипертензий, во-1-х, исследованию подвергаются мембраны нейтрофилов; во-2-х, используется ряд конкретных высокоинформативных параметров, характеризующих структурно-функциональное состояние липидной фазы мембраны нейтрофилов. Строго определенная совокупность динамики выбранных параметров позволяет проводить дифференциальную диагностику артериальных гипертензий различного генеза; и, в-3-х, метод является доступным любой клинико-биохимической лаборатории практического здравоохранения.

Согласно современным представлениям, наиболее перспективной клеточной популяцией в плане изучения патогенеза ЭГ являются нейтрофилы в силу многогранности своих функциональных возможностей. В настоящее время известно по крайней мере три механизма активного участия нейтрофилов в повышении периферического сосудистого сопротивления. Во-1-х, путем изменения реологических свойств самих нейтрофилов. Во-2-х, за счет выброса широкого спектра вазоактивных субстанций, в том числе высокоактивных кислородных радикалов, продуктов превращения арахидоновой кислоты и других. В 3-х, модулируя активность тромбоцитов с помощью тромбоцитактивирующего фактора и свободных кислородных радикалов. Активированные тромбоциты, в свою очередь, выделяют ряд вазоактивных веществ, повышающих общее периферическое сосудистое сопротивление. С учетом того, что высокое сосудистое периферическое сопротивление является краеугольным камнем патогенеза ЭГ, поиск новых методов дифференциальной диагностики ЭГ и симптоматических артериальных гипертензий, в частности, на фоне хронического пиелонефрита, при котором нейтрофильные гранулоциты напрямую участвуют в воспалительном процессе в почечной паренхиме, на основании мембранных тестов именно мембран нейтрофилов представляется перспективным направлением в кардиологии.

Способ дифференциальной диагностики артериальных гипертензий осуществляется следующим образом.

Для исследования использовалась венозная кровь, взятая из локтевой вены. Забор крови в количестве 5 мл производился натощак после 12-часового голодания. В качестве антикоагулянта использовался гепарин из расчета 25 ЕД на 1 мл крови. Посуда для забора и обработки крови была дважды силиконирована.

Для получения нейтрофилов цельную венозную кровь центрифугировали на двойном градиенте фиколл-верографина (плотности градиентов 1,077 и 1,093) в течении 45 мин при 1500 об/мин в роторе с горизонтальным расположением пробирок. На границе между градиентами образовывалось кольцо нейтрофилов. Морфологический контроль мазков показал, что в нижнем кольце 98-100% клеток были нейтрофилы. Определение жизнеспособности выделенных нейтрофилов с трипановым синим показало, что живых около 98-99% клеток. После выделения клеточная суспензия дважды отмывалась средой Хенкса без фенолового красного. Количество выделенных из крови нейтрофилов подсчитывали в камере Горяева и разводили средой Хенкса без фенолового красного до концентрации 10⁶ кл/мл. Общие липидные экстракты готовили из расчета 10⁵ клеток на один экстракт путем экстракцией липидов из мембран спирто-эфирной смесью в соотношении 3:1.

Определение фракций фосфолипидов лизофосфатидилхолина, сфингомиелина и фосфатидилэтаноламина проводили методом тонкослойной хроматографии на силуфоловых пластинах в герметически закрытой камере в системе растворителей, содержащих хлороформ метанол 25% аммиак воду в соотношении 30,0:8,8:1,0:0,2. Пластины проявляли в йодной камере, фракции фосфолипидов отмечали, ориентируясь на свидетели, и элюировали. Затем липоидный фосфор переводили в неорганический на песочной бане при 250^oC в течение 2 ч. Определение неорганического фосфора проводили микрометодом с использованием реактива, содержащего малахитовый зеленый на спектрофотометре СФ-26 при длине волны 655 нм. Результаты выражали в нмоль/10⁵ клеток.

Выделяли холестерин методом тонкослойной хроматографии на силуфоловых пластинах в герметически закрытой камере в системе растворителей, содержащей петролейный эфир-диэтиловый эфир-ледяную уксусную кислоту в соотношении 20,0:20,0:0,4. Пластины проявляли в водной камере, отмечали фракции свободного холестерина и эфиров холестерина. Количественное определение холестерина после элюации с пластин проводили методом Илка (реакция Либермана-Бурхарда) на спектрофотометре при длине волны 650 нм. Результаты выражали в нмоль/10⁵ клеток.

Всего нами обследовано 46 нелеченных больных гипертонической болезнью 11 стадии в возрасте 28-49 лет без сопутствующих заболеваний. Соотношение мужчин и женщин 1:2. Все больные находились на стационарном лечении в отделении артериальной гипертонии Тюменского НИИ клинической и профилактической кардиологии СО АМН РФ. Симптоматический характер артериальной гипертензии исключался по общепринятой двухэтапной схеме с использованием современного лабораторного, инструментального, ультразвукового, радионуклеидного и рентгенологического обследования. Окончательный диагноз ставился на основе критериев ВОЗ (1978). Средние цифры артериального давления были на момент обследования 172,4±2,8/116,2±1,4 мм рт. ст. при этом среднее артериальное давление было равно 135,0±2,1 мм. рт. ст.

В качестве сравнения нами обследовано 53 больных с симптоматической артериальной гипертензией на фоне хронического пиелонефрита. Все больные находились на стационарном лечении в отделении нефрологии Тюменской областной клинической больницы. При этом в результате проведенного комплексного обследования, которое включало лабораторную диагностику, инструментальное и рентгенологическое обследование органов мочевыделительной системы вплоть до биопсии почек был установлен диагноз хронического пиелонефрита. У 17 больных хронический пиелонефрит развился в результате дисметаболической нефропатии и нефролитиаза, у 18 в результате почечных аномалий, и у 18 больных был диагносцирован первичный пиелонефрит. Средние цифры артериального давления на момент обращения были 168,3±1,9/123,7±0,9 мм. рт. ст. среднее артериальное давление было равно 138,6±1,2 мм рт. ст.

В результате проведенных исследований выявлены следующие значения исследуемых мембранных параметров для Э0г и симптоматической артериальной гипертензии на фоне хронического пиелонефрита (см. таблицу).

Диагностический коэффициент (ДК) рассчитывается по следующему отношению исследуемых параметров липидного бислоя мембран нейтрофилов:

ЛФХ лизофосфатидилхолин
СМ сфингомиелин,
ФЭА фосфатидилэтаноламин,
Х_л холестерин.

В среднем для больных ЭГ ДК 1,27±0,03; для больных симптоматической артериальной гипертензией на фоне хронического пиелонефрита ДК 2,30±0,14. Вычисление этого показателя у каждого из обследованных больных и анализ полученных данных показали, что 90% больных ЭГ характерен ДК от 1,0 до 1,8; для 90% больных симптоматической артериальной гипертензией на фоне хронического пиелонефрита характерен ДК от 2,0 до 2,8. При значениях ДК от 1,8 до 2,0 дифференциальная диагностика сомнительна.

Клинические примеры:
1.Больной К. 36 лет, поступил в нефрологическое отделение Тюменской областной клинической больницы с предварительным диагнозом: гипертоническая болезнь 11 стадии.

При исследовании липидного спектра мембран нейтрофилов выявлено: уровень ЛФХ 0,080 нмоль/10⁵ клеток, СМ 0,029 нмоль/10⁵ клеток. ДК=2,55. Был сделан вывод о наличии у больного симптоматической артериальной гипертензии на фоне хронического пиелонефрита.

В дальнейшем на основании клинических данных, результатов полного лабораторно-инструментально-рентгенологического обследования был подтвержден диагноз симптоматической артериальной гипертензии на фоне хронического пиелонефрита. Больной был переведен в урологическое отделение, где в последующем выполнена операция по поводу нефролитиаза и произведена биопсия почечной ткани. Диагноз хронического пиелонефрита подтвержден гистологически.

2. Больная С. 23 года, поступила в отделение артериальной гипертонии Тюменского НИИ кардиологии с жалобами на умеренные головные боли при повышении артериального давления. Из анамнеза выявлено, что повышение артериального давления отмечается на протяжении 3 лет, максимальные цифры 180/110 мм рт. ст. оптимального артериального давления не знает. Из перенесенных заболеваний отмечает острый цистит 3 года назад и в прошлом году весной, по поводу которого нигде не обследовалась и не лечилась. Предварительный диагноз: гипертоническая болезнь II стадии медленно прогрессирующее течение.

При исследовании липидного спектра мембран нейтрофилов выявлено: уровень ЛФХ 0,058 нмоль/10⁵ клеток, СМ 0,044 нмоль/10⁵ клеток, ФЭА 0,070 нмоль/10⁵ клеток. Х_л 0,301 нмоль/10⁵ клеток. ДК=2,07. Был сделан вывод о наличии у больной симптоматической артериальной гипертензии на фоне хронического пиелонефрита.

В дальнейшем на основании комплексной оценки данных клинической картины, лабораторных и инструментальных исследований, включая ультразвуковое исследование почек, проведение радиоизотопной ренографии, динамической радионуклеидной сцинтиграфии почек, экскреторной урографии с последующей консультацией уролога и нефролога подтвержден диагноз хронического пиелонефрита с симптоматической артериальной гипертензией.

3. Больной А. 45 лет, поступил в нефрологическое отделение Тюменской областной клинической больницы по поводу значительного повышения артериального давления (максимально 220/140 мм. рт. ст.) при отсутствии каких-либо субъективных ощущений. Диагноз при поступлении: гипертоническая болезнь? симптоматическая (нефрогенная) артериальная гипертензия?
При исследовании липидного спектра мембран нейтрофилов выявлено: уровень ЛФХ 0,070 нмоль/10⁵ клеток, СМ 0,036 нмоль/10⁵ клеток, ФЭА 0,080 нмоль/10⁵ клеток, Х_л 0,338 нмоль/10⁵ клеток, ДК=2,28. На основании полученных данных было высказано мнение о наличии у больного симптоматической артериальной гипертензии на фоне хронического пиелонефрита.

При проведении в дальнейшем сложной комплексной лабораторной и инструментальной диагностики, включая прямую рентгеноконтрастную нефроангиографию, диагноз хронического пиелонефрита с симптоматической артериальной гипертензией был подтвержден.

4. Больной С. 31 год, был направлен на госпитализацию в отделение артериальной гипертонии Тюменского НИИ кардиологии с предварительным диагнозом: симптоматическая артериальная гипертензия на фоне хронического пиелонефрита.

При исследовании липидного спектра мембран нейтрофилов выявлено: уровень ЛФХ 0,048 нмоль/10⁵ клеток, СМ 0,121 нмоль/10⁵ клеток, ФЭА 0,011 нмоль/10⁵ клеток, Х_л 0,502 нмоль/10⁵ клеток. ДК=1,21. Был сделан вывод о наличии у больного гипертонической болезни II стадии медленно прогрессирующего течения.

В дальнейшем динамическое наблюдение за больным, комплексное клинико-лабораторно-инструментальное обследование по общепринятой двухэтапной схеме дифференциальной диагностики артериальных гипертензий позволило исключить диагноз симптоматической нефрогенной артериальной гипертензии. Окончательный диагноз: гипертоническая болезнь II стадия медленно прогрессирующее течение.

5. Больная М. 39 лет, поступила в отделение артериальной гипертонии Тюменского НИИ кардиологии с малосимптомной артериальной гипертензией (максимальное артериальное давление 170/115 мм. рт. ст.) для исключения симптоматического (нефрогенного) генеза гипертензии.

При исследовании липидного спектра мембран нейтрофилов выявлено: уровень ЛФХ 0,038 нмоль/10⁵ клеток, СМ 0,098 нмоль/10⁵ клеток, ФЭА 0,016 нмоль/10⁵ клеток, Х_л 0,455 нмоль/10⁵ клеток. ДК=1,32. Было высказано мнение о наличии у больной гипертонической болезни II стадии.

В дальнейшем в результате лабораторных и инструментальных исследований в сопоставлении с клинической картиной позволили исключить симптоматический генез артериальной гипертензии. Окончательный диагноз: гипертоническая болезнь II стадия медленно прогрессирующее течение.

6. Больная П. 27 лет, поступила в отделение артериальной гипертонии Тюменского НИИ кардиологии с предварительным диагнозом: симптоматическая (нефрогенная) артериальная гипертензия? гипертоническая болезнь II стадии?
При исследовании липидного спектра мембран нейтрофилов выявлено: уровень ЛФХ 0,044 нмоль/10⁵ клеток, СМ 0,106 нмоль/10⁵ клеток, ФЭА 0,014 нмоль/10⁵ клеток, Х_л 0,478 нмоль/10⁵ клеток. ДК=1,27. Было высказано мнение об эссенциальной артериальной гипертензии (гипертонической болезни II стадии).

В дальнейшем проведенное обследование по общепринятой двухэтапной схеме дифференциальной диагностики артериальных гипертензий с полным лабораторным исследованием биохимических параметров крови, анализов мочи общего, по Нечипоренко и по Зимницкому, ультразвуковым исследованием сердца и почек, радионуклеидных методов исследования органов мочевыделительной системы с помощью гамма-камры Омега-500 (США), экскреторной урографии и прямой рентгеноконтрастной нефроангиографии с последующей консультацией уролога и научного руководителя отделения артериальной гипертонии выставлен заключительный диагноз: гипертоническая болезнь II стадии медленно прогрессирующее течение.

Таким образом, разработанный способ дифференциальной диагностики ЭГ и симптоматической артериальной гипертензии на фоне хронического пиелонефрита является клинически высокоэффективным и технически простым и доступным рядовой клинико-биохимической лаборатории практического здравоохранения, безопасен для пациентов и не требует дорогостоящей аппаратуры и дефицитных материалов и реактивов и, следовательно, является экономичным.

Изобретение относится к медицине. Цель изобретения - повышение точности и информативности мембранных тестов для дифференциальной диагностики артериальных гипертензий, исключения дорогих и небезопасных для пациентов методов обследования и устранения использования сложной аппаратуры. Способ заключается в заборе крови, выделении нейтрофилов, из мембран которых экстрагируют липиды и получают липидные экстракты, определяют количество липидов по их оптической плотности и вычисляют диагностический коэффициент. Согласно изобретению в мембранах нейтрофилов определяют содержание фракций фосфолипидов - лизофосфатидилхолина (ЛФХ), сфингомиелина (СМ) и фосфатидилэтаноламина (ФЭА) и уровень холестерина (Х_л) по их оптической плотности волны для фосфолипидов 655 нм и 650 нм для холестерина, определяют диагностический коэффициент (ДК) по формуле:

и при значении ДК от 1,0 до 1,8 диагностируют эссенциальную гипертензию, а при значении ДК от 2,0 до 2,8 диагносцируют симптоматическую артериальную гипертонию на фоне хронического пиелонефрита. 1 табл.

Способ дифференциальной диагностики эссенциальной гипертензии и симптоматической нефрогенной артериальной гипертензии путем забора крови, выделения клеток крови, из мембран которых экстрагируют липиды и получают липидные экстракты, определяют количество липидов по их оптической плотности и вычисляют диагностический коэффициент, отличающийся тем, что, с целью повышения точности и информативности мембранных тестов для дифференциальной диагностики артериальных гипертензий, исключения дорогих и небезопасных для пациентов методов обследования и устранения необходимости использования сложной аппаратуры, в мембранах нейтрофилов определяют содержание фракций фосфолипидов лизофосфатидилхолина, сфингомиелина и фосфатидилэтаноламина и уровень холестерина по их оптической плотности при длине волны для фосфолипидов 655 нм, для холестерина 650 нм, а диагностический коэффициент (ДК) определяют по формуле

где ЛФХ лизофосфатилхолин (нмоль/10⁵ клеток)
СМ сфингомиелин (нмоль/10⁵ клеток)
ФЭА фосфатидилэтаноламин (нмоль/10⁵ клеток)
Хл холестерин (нмоль/10⁵ клеток),
и при значении ДК 1,0 1,8 диагносцируют эссенциальную гипертензию, а при значении ДК 2,0 2,8 диагносцируют симптоматическую артериальную гипертензию на фоне хронического пиелонефрита.