СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО СРЕДСТВА Российский патент 1997 года по МПК A61K38/21 

Изобретение относятся к биотехнологии и может быть использовано для получения препаратов рекомбинантного альфа-2-интерферона человека (RhIFN-α2) в качестве субстанции при производстве противоопухолевых средств на основе нерастворимой формы рекомбинантного альфа-2-интерфеpoнa человека, а также для исследовательских целей.

Альфа-2-интерферон является представителем обширного класса цитокинов. Наряду с хорошо исследованной противовирусной активностью белок проявляет противоопухолевое и иммуномодулирующее действие. Для широкого применения препаратов на основе альфа-2-интерферона необходимо его масштабное производство. Последнее может быть обеспечено путем конструирования продуцентов с использованием методологии рекомбинантных ДНК (D.V.Goedell et al. Nature, 1980, vol. 287, p. 411a: Кравченко В. В. и др. заявка РФ N 5023641/13 от 22.01.92) RhIFN-α2, выделенный из клеток E.coli, проявляет все основные биологические свойства природного белка.

Одной из проблем, связанных с получением лекарственных средств на основе рекомбинантного альфа-2-интерферона, является обеспечение высокой чистоты препарата. При получении высокоочищенного белка большое внимание уделяется удалению частично деградированных, неправильно свернутых, а также олигомерных форм RhIFN-альфа-2 (S. J. Talnovski et al. Methods Enzymol. 1986, vol. 119, p. 153-165; патент США N 4534906; патент США N 4432895) по двум причинам: 1) олигомерные формы проявляют меньшую удельную активность; 2) не исключается возможность проявления побочной активности указанными компонентами.

В отличие от альфа-2-интерферона и его растворимых олигомерных форм нерастворимые олигомеры белка не проявляют антивирусную активность in vitro (J. A. Langer, S. Pestka, Methods anzymol. 1986, vol. 119, p.248-255). Поэтому использование нерастворимой формы рекомбинантного альфа-2-интерферона человека, основу которого составляют олигомеры, в качестве противоопухолевого средства является неочевидным решением.

Сведений о противоопухолевых средствах на основе нерастворимой формы рекомбинантного альфа-2-интерферона, полученной без специального добавления осаждающих агентов, в литературе не обнаружено.

В качестве прототипа может быть рассмотрен способ получения нерастворимого комплекса альфа-интерферона и ионов меди, предназначенный для получения инъекционных препаратов (патент США N 4871538). Препарат получают смешиванием альфа-интерферона в концентрации 0,1-1 мг/мл, хлорида, ацетата, сульфата или цитрата меди (0,05-0,09 мг/мл) в буфере с pH 7,5-3,2. Хотя по составу компонентов препарат прост, значения оптимумов концентраций белка, солей меди, величины pH лежат в узких пределах и отклонения от этих значений приводят к резкому уменьшению выхода нерастворимой формы альфа-интерферона. Кроме того, присутствие в среде других белков, способных образовывать комплексы с ионами меди, препятствует образованно комплекса и вызывает растворение уже образовавшегося.

Целью изобретения является упрощение способа получения нерастворимой формы рекомбинантного альфа-2-интерферона человека и повышение стабильности целевого продукта.

Для достижения цели получают нерастворимую олигомерную форму рекомбинантного альфа-2-интерферона человека, представляющую собой смесь моно-, ди- и олигомеров с молекулярно-весовым распределением от 17 до 5000 кД, либо из нерастворимых тел включения (ТВ), образующихся в клетках штаммов-суперпродуцентов, либо из высокоочищенного водорастворимого RhIFN-α-222.

Способ получения нерастворимой формы a2-2-интерферона из тел включения.

В качестве источника рекомбинантного альфа-2-интерферона человека использован трансформированный плазмидой pIF1⁶ кодирующей синтез RhIFN-альфа-2, штамм E.coli (заявка РФ N 5023641/13). Суперпродукция рекомбинантного белка сопровождается образованием нерастворимых тел включения альфа-2-интерферона.

Нерастворимые тела включения после лизиса или ультразвуковой дезинтеграции клеток E.coli SG 20050 (pIF 16) осаждают центрифугированием вместе с обломками клеточных стенок. Удаления значительной части примесных белков достигают промывкой осадка буферными растворами, растворами неионного детергента, например тритона Х-100 в концентрации до 1%) и денатурирующих агентов (например мочевины в концентрации 3-8 М) Потери альфа-2-интерферона при этом незначительны. Полное растворение интерферона проводят в растворах 5-7 М хлорида гуанидиния (Gdm.HCl) и вновь осаждают альфа-2-интерферон, удаляя денатурирующий агент диализом полученного раствора против воды или буфера. В результате солюбилизации и повторного осаждения достигают дополнительного удаления примесных белков.

В итоге проведенных исследований был выбран следующий метод получения нерастворимой, частично очищенной формы рекомбинантного альфа-2-интерферона:
1) разрушение клеток, удаление растворимой фракции;
2) промывка нерастворимого материала (ТВ) растворами с повышающейся концентрацией мочевины для удаления балластных белков;
3) растворение осадка 7 М Gdm.HCl;
4) осаждение RhIFN-2 диалиэом против воды, промывка осадка водой.

Выпавший в осадок белок собирают центрифугированием, промывают дистиллированной водой и хранят в виде суспензии в воде. При необходимости белок может быть лиофильно высушен или храниться в виде раствора в 7 М Gdm.HCL.

Нерастворимая форма имеет следующие характеристики. Содержание альфа-2-интерферона, оцененное по результатам гель-электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия в редуцирующих условиях составляет 78-80% Основная часть белка представляет собой олигомеры с неприродными межмолекулярными дисульфидными мостиками. Молекулярная масса SS-олигомеров очень высока, т.к. они практически не фракционируются в 15%-ном полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия, но без предварительной обработки 2-меркаптоэтанолом, и задерживаются на границе между концентрирующим и разделяющим гелями.

Способ получения нерастворимой формы из растворимого RhIFN-α.

В нефракционированных телах включения в зависимости от фазы роста клеток продуцента обнаруживают различное количество клеточных компонентов: белков мембраны, рибосомальных белков, хозяйской и плазмидной ДНК, РНК и др. Учитывая высокие требования к чистоте рекомбинантных белков, являющихся субстанциями лекарственных средств, нерастворимая форма альфа-2-интерферона может быть получена из высокоочищенного водорастворимого белка. Для стандартизации процедуры очистки и процесса ренатурации осуществляют разрушение нерастворимой формы, получение которой описано выше, путем восстановления дисульфидных связей и обратимого сульфитолиза образовавшихся тиолов. После сульфитолиза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия без обработки 2-меркаптоэтанолом обнаруживалась только мономерная форма интерферона. Процесс ренатурации сульфитированной мономерной формы проводят в специально подобранных условиях в смеси окисленного и восстановленного глутатионов. Выбранный режим ренатурации способствовал не только удалению модифицирующих групп, но и преимущественно правильному замыканию дисульфидных связей. Окончательную очистку проводят методом ионообменной хроматографии. Полученный таким образом альфа-2-интерферон имел высокую степень чистоты и хорошую растворимость в воде. В целом эта схема получения водорастворимого альфа-2-интерферона включает следующие основные стадии:
1) разрушение биомассы и получение частично очищенной нерастворимой формы RhIFN-a2 как описано выше;
2) разрушение SS-олигомеров и перевод всех молекул белка в одну форму сульфитолизом;
3) ренатурацию сульфитированного белка в присутствии смеси окисленного и восстановленного глутатианов;
4) дополнительную очистку хроматографией на катионите.

Очищенный по описанной схеме RhIFN-α2 имеет следующие характеристики:
1) концентрация водорастворимого альфа-2-интерферона, определенная по методу Лоури составляет 0,3-1,25 мг/мл;
2) в полностью денатурирующих условиях белок имеет высокую степень чистоты, более 95% В препарате в зависимости от партии может обнаруживаться 1-4% белка, соответствующего по молекулярной массе димеру альфа-2-интерферона;
3) в отсутствие предобработки 2-меркаптоэтанолом при электрофорезе в нативных условиях обнаруживается основная полоса мономера альфа-2-интерферона и 1 или 2 минорных полосы его конформационных изомеров;
4) высокая степень чистоты подтверждается результатами ВЭЖХ;
5) примесь белков E.coli SG 200 50, определенная методом иммуноферментного анализа, менее 100 нг/мг альфа-2-интерферона;
6) примесь бактериальной ДНK, определенная с помощью гибридизации с мечеными зондами, менее 6 нг/мг;
7) примесь липополисахаридов, определенная с применением TAL-теста, 0,3-0,4 нг/мг белка;
8) удельная активность препарата, определенная по подавлению цитопатического действия вируса везикулярного стоматита на культуру клеток кожно-мышечной ткани человека L68 составляет (1-6)•10⁸ МЕ/мг;
9) при внутрибрюшинном введении беспородным мышам в дозе 10⁶ ед/мл/мышь гибели животных не наблюдалось (группа из 5 животных);
10) внутривенное введение 10⁶ ед/мл/кг веса не вызывало пирогенной реакции у кроликов в течение 3 ч.

Получение нерастворимой фракции из высокоочищенного альфа-2-интерферона осуществляют путем восстановления природных дисульфидных связей с последующим окислением образовавшихся тиолов в нейтральной или слабощелочной среде в присутствии кислорода воздуха. Образующиеся олигомеры выпадают в осадок, при гель-электрофорезе без предварительной обработки материала 2-меркаптоэтанолом выявляются в виде набора дискретных полос. Наряду с олигомерной в осадке обнаруживается мономерная форма RhIFN-α2. Способность к образованию нерастворимых олигомерных форм является свойством белка, не зависящим от природы штамма-хозяина, и может быть использована для получения нерастворимой фракции рекомбинантного альфа-2-интерферона, выделенного из различных источников.

Пример 1. 5 г биомассы E.coli SG 200 50 (pIF 16), суперпродуцирующей альфа-2-интерферон человека, суспендируют в 100 мл буфера А (50 мМ трис HCl, pH 7,0-8,0), содержащего 2 мМ ЭДТА. Суспензию озвучивают при максимальной мощности пятью сериями длительностью 1 мин с интервалами в 1-2 мин, затем центрифугируют при 12000 об/мин в течение 30 мин. Собранный осадок суспендируют в 100 мл буфера А, содержащего 2 мМ ЭДТА и 1%-ный тритон Х-100, перемешивают в течение 30 мин и собирают осадок центрифугированием как описано выше. Собранный осадок последовательно обрабатывают, как описано выше, растворами 3 и 6 М мочевины в буфере А. Собранный после промывок осадок растворяют в буфере А, содержащем 7М Gdm.HCL, в течение 1 ч, полученный раствор центрифугируют при 12000 об/мин в течение 30 мин и собирают супернатант. Раствор переносят в диализный мешок и диализуют против дистиллированной воды в течение суток. Выпавший осадок нерастворимой формы RhIFN-α2 собирают центрифугированием при 12000 об/мин, 2^oC, в течение 10 мин, суспендируют в 100 мл воды и снова центрифугируют. Осадок суспендируют в 20 мл воды и хранят в виде суспензии при 4^oС. Электрофоретическая чистота альфа-2-интерферона в полностью денатурирующих условиях около 80% Выход 30 мг/г биомассы. (Препарат N 1).

Пример 2. К 3,4 мл раствора частично очищенной нерастворимой формы альфа-2-интерферона (11,75 мг/мл) добавляют 23 мл буфера А и 2,7 мл раствора для сульфитирования, содержащего 200 мг/мл Na₂S₄O₆ и 100 мг/мл Na₂S₄O₆ в воде, и оставляют на 20 ч при комнатной температуре.

Все последующие процедуры проводят при температуре 4-6^oC. Раствор сульфитированного белка диализуют 16 ч против 10 л 5 мМ раствора бикарбоната аммония, pH 9,0. Образовавшийся при диализе осадок отделяют центрифугированием при 12000 об/мин в течение 20 мин при 2^oC. К супернатанту добавляют 160 мл 0,1 М трис HCL, pH 8,0, содержащего 2 мМ ЭДТА. К полученному раствору добавляют 49 мг восстановленного глутатиона и 9,8 мг окисленного глутатиона, смесь перемешивают на магнитной мешалке и оставляют на 16 ч для ренатурации белка.

Раствор ренатурированного белка диализуют против 10 л 50 мМ раствора ацетата натрия, pH 4,5, в течение 16 ч. Диализованный раствор наносят со скоростью 15 мл/ч на колонку объемом 10 мл, заполненную карбоксиметилцеллюлозой и уравновешенную 0,1 М ацетатом натрия, pH 5,0. После нанесения раствора колонку промывают 50 мл 0,1 М ацетата натрия, pH 5,0 и элюируют белок линейным градиентом ацетата натрия (от 0,1 до 0,5 М), pH 5,0. Общий объем градиента 100 мл, скорость элюции 20 мл/ч, объем фракций 3 мл. Выход альфа-2-интерферона определяют по пику поглощения при 280 нм (обычно элюируется 0,3 М солью), подтверждают его результатами электрофоретического анализа в 15% -ном полиакриламидном геле в полностью денатурирующих условиях при внесении в лунку 30 мкл анализируемой фракции. Фракции, содержащие альфа-2-интepфepoн, объединяют, измеряют объем, концентрацию белка и биологическую активность.

Пример 3. 35 мл содержащего альфа-2-интерферон раствора (концентрация 0,34 мг/мл), полученного после хроматографии, переносят в диализный мешок и диализуют против 4 л 50 мМ трис HCI, pH 9,0 в течение 16 ч при 4^oC. К раствору добавляют 2-меркаптоэтанол до конечной концентрации 0,1 М, выдерживают смесь при 37^oC в течение 3 ч и вновь подвергают диализу против двух смен по 2 л 50 мМ трис HCI, pH 7,0 в течение 20 ч. Выпавший осадок нерастворимой формы альфа-2-интерферона собирают центрифугированием при 10000 об/мин в течение 20 мин. Осадок суспендируют в 2,6 мл трис HCI, 7,0, и хранят в виде суспензии до дальнейшего использования. Выход рекомбинантного альфа-2-интерферона 10,6 мг. (Пример N 2)
Пример 4. Исследование противоопухолевой активности нерастворимой формы RhIFN-α2 (Препарат N 1).

Тестирование противоопухолевой активности нерастворимой формы рекомбинантного альфа-2-интерферона человека проводят методом (Subrenal capsule assay, A. Bogden et al. Proc. Sympos. 1970, p.231-250) с использованием в качестве моделей первичных опухолей молочной железы, меланомы кожи и метастазов рака молочной железы человека. Для этого ксенографты (кусочки ткани) опухоли имплантируют под почечную капсулу мышей и определяют скорость роста опухоли на шестой день путем измерения их массы. В качестве контроля используют физиологический раствор и высокоочищенный водорастворимый рекомбинантный альфа-2-интерферон человека (коммерческий препарат "Реаферон"). Количество вводимой нерастворимой формы рекомбинантного альфа-2-интерферона определяют, исходя из величины удельной активности препарата.

Опухолевую ткань, удаленную у больных во время хирургической операции, помещают в питательную среду с антибиотиками и после кратковременной промывки (20-30 мин) разрезают на небольшие фрагменты. Последние тщательно отделяют от некротических или кровянистых участков, от макроскопически видимой жировой ткани и только после этого разрезают на мелкие кусочки. Отбирают образцы с массой 1 мг и имплантируют мышам (С 57 BI/6Х ДВА/F₁) под капсулу почки (по 2 ксенографта каждому животному), операцию проводят под гексаналовым наркозом, все этапы операции проводят в стерильных условиях. Животных забивают на 6-ой день под эфирным наркозом, ксенографты извлекают и взвешивают.

Суспензию нерастворимой фракции RhIFN-α2 (препарат N 1) коммерческий препарат RhIFN-2 ("Реаферон", НПО "Вектор") вводят мышам внутрибрюшинно (в/б) в объеме 0,5 мл ежедневно в течение 5 дней. Разовая доза реаферона составляет 2•10⁴ МЕ на животное. Нерастворимую фракцию вводят в эквивалентном весовом (по белку) количестве (0,1 мкг, принимая удельную активность растворимого интерферона равной 2•10⁸ МЕ/мг). Каждая группа включает по 10 опытных и 10 контрольных животных. Из результатов опыта, представленных в табл. 1, видно, что нерастворимая фракция RhIFN-α2 с содержанием интерферона 80% обладает выраженным противоопухолевым действием.

Пример 5. Сравнительная оценка препарата N 1 из ТВ и Реаферона по противоопухолевому действию на метастатическую ткань рака молочной железы в лимфоузел.

Для гетеротрансплантации опухолевую ткань обрабатывают и вводят под капсулу почки мышей, а после лечения извлекают и взвешивают по методу, описанному в примере 4.

Для лечения опытным мышам препарат нерастворимой фракции RhIFN-α2 (пример 1) и альфа-2-интерферон вводят внутримышечно (в/м) ежедневно в течение 5 дней по 0,2 мл, разовая доза составляет 2•10⁴ МЕ на мышь. В эксперименте используют no 10 опытных и 10 контрольных животных. Каждой особи имплантируют по 2 ксенографта. Результаты представлены в табл. 2. Видно, что нерастворимая фракция RhIFN-α22 проявляет более высокую, чем растворимый альфа-2-интерферон противораковую активность в отношении метастазов рака молочной железа человека.

Пример 6. Влияние нерастворимой фракции RhIFN-2, гомогенной по a22-IFN, из ТВ N 2 и реаферона на первичную раковую опухоль молочной железы человека.

Процесс гетеротрансплантации опухолевой ткани под капсулу почки мышей и выделение ксенографтов после лечения проводят по способу, описанному в примере 4.

Для лечения каждый препарат вводят внутрибрюшинно (в/б) и внутримышечно (в/м) ежедневно на протяжении 5 суток. Разовая (на инъекцию) доза составляет 2•10⁴ME на мышь. Объем вводимого материала составляет 0,5 мл при в/м введении или 0,2 мл при в/м введении. Каждая группа включает по 10 опытных и 10 контрольных животных. Результаты опытов представлены в табл. 3.

Полученные данные свидетельствуют о том, что нерастворимая фракция RhIFN-a2 гомогенная по α2-интерферону, обладает более выраженным противоопухолевым действием на ткань первичной раковой опухоли молочной железы человека.

Пример 7. Влияние препарата N 2 на ткани метастазов (в регионарные лимфоузлы) опуХоли молочной железы человека.

Кусочки метастазирующей ткани опухоли молочной железы человека обрабатывают, разрезают на мелкие кусочки весом 1 мг и переносят под капсулу почки мышей по методу, описанному в примере 4. Каждой мыши имплантируют по 2 ксенографта. Опытных мышей лечат, контрольный препарат не вводят. Лечение проводят по схеме, описанной в примере 4. ЖивотныХ забивают на 6-ой день, извлекают ксенографты и взвешивают. В опытах и контроле используют по 10 особей. Результаты приведены в табл. 4.

Из табл. 4 видно, что альфа-2-интерферон и препарат N 2 обладают выраженным противоопухолевым действием. Препарат N 2 вызывает регрессию опухоли.

Пример 8. Изучение эффекта препарата RhIFN-α2 из ткани меланомы кожи (первичная опухоль).

Для изучения противоопухолевого и/или ингибирующего рост эффекта препаратов кусочки ткани первичной опухоли меланомы кожи обрабатывают, разрезают, берут мелкие кусочки весом 1 мг и имплантируют под капсулу почки мышам согласно методу, описанному в примере 4. Каждой мыши имплантируют по 2 ксенографта. В опыт и контроль брали по 10 мышей. Опытных мышей лечат препаратами также как в примере 4. Через 5 дней мышей забивают, извлекают трансплантаты и взвешивают на торсионных весах. Результаты наблюдений представлены в табл. 5.

В результате экспериментов показан значительный ингибирующий эффект препаратов на ткани меланомы кожи. При этом наблюдается даже регрессия, уменьшение массы ксенографтов.

Таким образом, предложен способ получения нерастворимой формы RhIFN-α2, обладающей противоопухолевой активностью при тестировании в SRCA-тесте, при использовании в качестве модели опухоли молочной железы и меланомы человека. Чувствительность меланомы к действию препарата выше, чем чувствительность рака молочной железы. Чувствительность метастатической ткани к действию нерастворимой формы RhIFN-α2 выше чувствительности первичных опухолей.

Изобретение относится к биотехнологии и медицине и касается способа получения нерастворимой формы рекомбинантного альфа-2-интерферона человека. Способ получения противоопухолевого средства включает приготовление смеси моно-, ди- и олигомеров рекомбинантного альфа-2-интерферона человека с молекулярно-весовым распределением от 17 до 5000 кД путем восстановления дисульфидных связей рекомбинантного белка и окисления образовавшихся тиолов. Нерастворимая форма может быть получена, исходя из водорастворимого рекомбинантного альфа-2-интерферона человека или непосредственно из тел включения, образующихся в клетках штамма-суперпродуцента. Изобретением достигается упрощение способа получения нерастворимой формы рекомбинантного альфа-2-интерферона человека и повышение стабильности целевого продукта. 2 з.п. ф-лы, 5 тaбл.

1. Способ получения противоопухолевого средства на основе нерастворимой формы альфа-2-интерферона, отличающийся тем, что получают нерастворимую смесь моно-, ди- и олигомеров рекомбинантного альфа-2-интерферона человека с молекулярно-массовым распределением от 17 до 5000 кД путем восстановления дисульфитных связей рекомбинантного белка и окисления образовавшихся тиолов. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что нерастворимую форму альфа-2-интерферона получают путем восстановления водорастворимого рекомбинантного альфа-2-интерферона человека в присутствии восстанавливающего дисульфидные связи агента при рН 7 10, диализуют против воды или буферного раствора в отсутствие восстанавливающего агента в течение суток до образования осадка целевого продукта. 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что получают нерастворимую форму альфа-2-интерферона непосредственно из тел включения, образующихся в клетках штамма суперпродуцента, для чего бактериальные клетки разрушают, отделяют водорастворимые компоненты центрифугированием, примесные компоненты последовательно экстрагируют растворами 0,1 1,0% тритона Х100, 3 М и 6 М мочевины, растворяют осадок в 7 М хлорида гаунидина и осаждают белок диализом против воды или буферного раствора, не содержащих солей гуанидина.