Штамм бактерий ВRеVIвастеRIUм Sp., используемый для очистки сточных вод от акриламида и акриловой кислоты Советский патент 1992 года по МПК C02F3/34 

Изобретение относится к прикладной микробиологии и касается получения нового штамма бактерии используемого для локальной очистки сточных вод от акриламида и акриловой кислоты

Акрилзммд является основой для получения полимерных материалов имеющих широкое применение Полимеоы и сополимеры акриламила используются в химической нефтяной и горнорудной промышленности на целлюлозно-бумажных предприятиях Продукты из акриламида и целлюлозы можно применять в качестве загустителей в красителях для тканей Акриламид может быть использован для специфической химической модификации белков что важно для изучения механизма каталитического действия ферментов

Современная техноло.ия производства акрипамида не обеспечивает предотвращения его попадания в атмосферу и сточные воды предприятия (недостаточная герметичность реакторов наличие открытых поверхностей на фильтрах малая эффективность вентиляционных систем открытые смотровые люки реакторов) Для дополнительной очистки стоков от акоилзмида наиболее эффективными и рентабельными являются микробиологические методы детоксикации стоков

Известны штаммы-аналоги способные к деградации акриламида и акриловой кислоты

Наиболее близкой к предлагаемому штамму является культура бактерии Brevibacterium ammoniaqenes I AM 1641, которая утилизирует за 48 ч 1 г/л акрилами- дй при микробной нагрузке 1 г/л (про сырому весу) Эта же культура разрушает 0,2 г/л акриламида содержащегося в сточных водах на 96% за 24 ч

сл

С

l«d

сл

ю

XJ

Целью изобретения является получение штамма с высокой биодеструктивной активностью, способного деградировать в сточных водах акриламид и акриловую кислоту в более высоких концентрациях и с большей скоростью.

Полученный штамм Brevibacterium sp. 12 ПА депонирован в Центральном музее промышленных микроорганизмов ВНИИ генетики и характеризуется следующими морфологическими, культуральными и физиологическими свойствами.

Морфологические свойства. Молодые клетки штамма имеют форму палочек средней величины, расположенных поодиночке, попарно и небольшими цепочками. Грампо- зитивные. Стареющая культура (2-3 сут) представлена коккобациллами, расположенными хаотично Спор и капсул не образуют, Подвижные, Штамм размножается простым делением, образуя короткие неразветвленные палочки.

Культуральные свойства. Прототроф, аэроб, оптимальная температура роста 28 - ЗСПг:. Растет при 5 - 10 и 40°С. Оптимум рН для развития культуры 7,4 ± 0,2, хотя рост наблюдается также при р Н среды 6-9 Колонми на мясо-пептонном агаре средних размеров (2 - 3 мм), пигментированные, яр ко-желтый пигмент. При культивировании, штамма на специапьных средах образования водорастворимых или флюоресцирующих пигментов не происходит. Колонии правильной округлой формы, непрозрачные. Ободок вокруг колоний плоский, колонии слегка выпуклые. Край колонии ровный, по верхность гладкая, блестящая. На мясо-пептонном бульоне рост в виде равномерного помутнения всей среды и хлопьевидного осадка на дне.

Биохимические свойства, Оксидазоне- „гативен, каталазопозитивен, Желатиназу, фенилэланмндезаминазу, липазу, лецити- назу, аргинингидралазу, лизиндекарбокси- лазу, орнитиндекарбоксилазу, уреазу не образует. Тесты на OF-среде с глюкозой, мальтозой, фруктозой дают положительную реакцию, на среде с арабинозой,ксилозой, маннитом - алкализация, На средах, содержащих лактозу, сахарозу, рамнозу, маино- зу, милибиозу, рафинозу, трегалозу, сорбит, инозит, дульцит, адонит, салицин, инулин - щелочение. Растет в присутствии 6,5% NaCI, редуцирует нитраты в нитриты. Не растет на средах Мак-Конки и Плоскарева. На крбвяном агаре гемолиза эритроцитов не дает. Индол и сероводород не образует.

Патогенность штамма определяли на белых мышах интраперитонеальным введе

нием взвеси бактерий 5,109 кл/мл. Отсутствие каких-либо патологических изменений во внутренних органах мышей позволяет сделать вывод об авирулентности культуры.

Штамм Brevibacterium sp 13 ПА выделен из почвы с производства акрилонитрила методом накопительной культуры с испопь- зованием в качестве ростовою субстрата

пропионэмида.

Сущность изобретения в том, что предлагаемый штамм способен разрушать в минеральной среде 4 г/л акриламида и 2,5 г/л акриловой кислоты за 24 ч (микробная нагрузка 10 кл./мл), используя их в качестве единственного источника углерода и азота в случае акриламида или в качестве источника углерода и энергии в случае акриловой кислоты.

П р и м с р 1. Выделение штамма

Brevibacierium sp.13 ПА.

Микроорганизм-деструктор акриламида и акриловой шепоты выделен из почвы с производства акрилонитрила методом накопительной культуры. Навеску почвы 1 г тщательно ресуспендировали в 10 мл физиологического раствора и настаивали в течение 1 ч Надосадочную жидкость в количестве 1 мл вносили вереду следующего состава, г: глюкоза 0,5; пептон 1,0; КаНРО 0,1; 0,1; дистиллированная вода 1000 мл; рН 7,0 iO,2; пропионамид - начальная концентрация 0,1 г/л

Суспензию (50 мл) в эрленмайеровских

колбах емкостью 300 мл инкубируют при 28 - 30(°С при круговом перемешивании Ежедневно сослав культуральной жидкости наполовину обновляли Концентрацию пропионамида в среде увеличивали ступенчато от 0 1 до 20 г/л.

За месяц адаптирования из среды были полностью удалены пептон и глюкоза. По истечении двухмесячного пассирования на пропионами- де производипи высев культуральной жидкости на чашки с плотной питательной средой состзва, г/л: MgSO/i 0.1; КгНРО 0,1, гпицерин 5; акриламид 5; ai ар-агар 1,5; рН 7,0±0 2.

В результате была выращена культура Brevibacterium sp. 13 ПА, утилизирующая

акриламид, акриловую кислоту в качестве единственного источника углерода и азота, или углерода и энергии Деструктивную активность штамма проверяли в жидкой синтетической среде,

Количественное определение акриламида и акриловой кислоты проводили методом гззожидкостной хроматографии на хроматографе ЛХМ-80, с пламенно-ионизационным детектором В качестве неподвижной фазы использовали Roop ex-400. Время

анализа акриламидз 8 мин, акриловой кислоты 3 мин.

П р и м е р 2. Использование штамма Brevibacterium sp 13 ПА в качестве деструктора акриламида.

Штамм, предварительно индуцированный в течение суток на питательной среде с пропионамидом в качество индуктора (5 г/л), культивировали в колбах Эрленмайера на жидкой синтетической среде состава, г/л, MgSCM 0,2; К2НР04 0,1; дистиллированная вода 1000 мл; рН 7,2 - 0,2, в объеме 50 мл. Микробная нагрузка 10 , 10 , 10 кл/мп. В качестве источника углерода и азота вносили экриламид в концентрации 2,5 и 5,0 г/л. Колбы помещали на качалку (120 об/мич) и инкубировали при 28 - 30°С. Концентрацию акриламида определяли методом ГЖХ.

П р и м е р 3 Использование штамма Brevibacterium sp 13 ПА в качестве деструктора акриловой кислоты.

Штамм культивировали аналогично примеру 2, В качестве источника углерода и энергии использовали акриловую кислоту в концентрации 1 и 2,5 г/л рН среды доводили до 7,0 с помощью 10%-ного водного рас твора аммиака, который одновременно служит источником азота. Микробная нагрузка 10 кл./мл. Предварительного индуцирования штамма в случае деструкции акриловой КИСЛОТУ не требовалось.

П р и м е р 4. Испытание штамма Brevibacterium sp, 13 ПА для очистки сточных вод.

Сточные воды опытного производства акриламида и лолиакриламида инокулиро- вали культурой Brevibacterium sp. 13 ПА (микробная нагрузка 10 кл./мл). Время экспозиции 24 ч, температура 28°С, периодическое перемешивание. Бактериальную массу отделяли центрифугированием в течение 40 мин при 7000 об/мин. Концентрацию акриламида и акриловой кислоты определяли аналогично примеру 1.

Результаты испытания биодеструктивной активности предлагаемого штамма, а также известного приведены в табл.1 и 2.

Предлагаемый штамм значительно превосходит известный по своим деструктивным характеристикам (скорость утилизации субстрата и максимально утилизируемым концентрациям субстрата) Апробированная культура разрушает 5 г/л акриламида за 28 ч. Присутствие акриловой кислоты в среде не оказывает влияния на деструктивную активность предлагаемого штамма в отношении акриламида. После полного исчезновения из среды акриламида начинается

0 процесс утилизации акриловой кислоты, образовавшейся эквивалентно количеств разрушенного акриламида. Помимо отогг штамм может утилизировать акрмлову,., кислоту как самостоятельный единствен5 ный источник углерода при его максимальном содержании в среде 2,5 г/л за 24 ч.

Испытания штамма в реальных промышленных стоках показали его жизнеспособность и высокую ферментативную

0 активность, Установлено, что за 24 ч культура Brevibacterium sp. 13 ПА деструктирует 4,37 г/л акриламида, содержащегося в сточных водах. Метаболитом процесса выступает акриловая кислота, которая Б

5 дальнейшем полностью утилизируется куль турой за 24 ч, выступая в качестве источник углерода и энергии.

Испытания проведены на 5 образцах сточных вод. Наличие в стоках акрилонитри0 ла 0,43%, солей цинка (11)1,82 мг/л, меди (II) 10,0 мг/л, железа (III), сербиталя и толуола не снижает биодеструктивной активности штамма.

Деструктивная активность штамма про5 является в широком диапазоне рН 6-9, поэтому необходимость регулирования рН стоков отпадает.

Таким образом, предлагаемый штамм Brevibacterium sp. 13 ПА обладает значи0 тельной деструктивной активностью, прошел испытания в промышленных сточных водах и может быть рекомендован к использованию для локальной очистки сточных вод от акриламида и акриловой кислоты.

5 Формула изобретения

Штамм бактерий Brevibacterium sp. ВКПМ В-4987, используемый для очистки сточных вод от акриламида и акриловой кислоты.

Т g б л и ц а 1

Применение очистка сточных вод от акрипамида и акриловой кислоты Сущ ность штамм выделен из почвы спроизвод ством акрилонитрила с использованием в качестве ростового субстрата - пропиона мидз Штамм депонирован во Всеюсоюзной коллекции микроорганизмов под номером ВКПМ В 4987 Культура штамма утилизирует субстрат, содержащий акриламид в количестве 5 г/л за 28 ч при микробной нагрузке 1 32 г/л субстрата 2 табл

Штамм

Начальная концент- рация субстрата i /л

Brevlbacterium sp 13

ПА В -4987

Brevibacterium

dmmoniagenes AM

1641 (известный)

Микробная нагрузка 1 QЈ-cy2ЈMyj5Cii.Jl/iL

Т э б л и ц а 2 Время утилизации, ч

1,32

28

48