ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI - ПРОДУЦЕНТ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ РЕСТРИКЦИИ ECO 75 KI Российский патент 1996 года по МПК C12N9/14 C12N9/14 C12R1/19 

Изобретение относится к биотехнологии и касается нового штамма бактерий Escherichia coli, который может быть использован для получения эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы), узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5'-GPuGCPy! C-3' в составе двухцепочечной ДНК. Рестриктаза Eco75kI, продуцируемая предлагаемым штаммом, является изошизомером известной рестриктазы Banll (1) и может найти применение в геноинженерных исследованиях в экспериментах по конструированию рекомбинантных ДНК in vitro, при изучении первичной структуры ДНК и т. д.

В статье Sugisaki H. с соавторами [1] описана рестриктаза Banll, полученная из штамма Bacillus anenrinolyticus, которая узнает и расщепляет участок ДНК 5'-GPuGCPy!C-3'. Также известны изошизомеры рестриктазы Banll, например, HgiJll [2] Eco261 [3] Bvul [4] EcoT381 [5] выделенные из различных штаммов, в том числе и из Escherichia coli. Наиболее близким к предлагаемому штамму является штамм Escherichia coli RFL26, продуцирующий рестриктазу Eco261. Выход очищенного фермента Eco261 составляет 200 ед/г сырой биомассы.

Задачей, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, является получение штамма, продуцирующего рестриктазу заданной специфичности с более высоким выходом, быстро растущего на обычных питательных средах.

Предлагаемый штамм Escherichia coli 75к был получен в результате целенаправленного поиска штаммов продуцентов рестриктаз среди клинических изолятов (г. Киев) при помощи разработанного нами метода тестирования активности в экстрактах, полученных из отдельно взятых колоний, выросших на агаризованной среде, с последующим электрофорезом продуктов расщепления ДНК в агарозном геле. Содержание рестриктазы Eco75kI в предлагаемом штамме 200000 ед/г сырой биомассы клеток.

Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов при ИБФМ РАН и хранится в ней под номером ВКМ В-2007Д.

Штамм Escherichia coli ВКМ В-2007Д имеет следующие характеристики.

Культурально-морфологические признаки.

Клетки прямые, палочковидные, размером 0,7-0,8 мкм в поперечнике и 2-3 мкм, иногда 5 мкм в длину, подвижные, грамотрицательные, с латеральными жгутиками. Располагаются одиночно, парами или цепочками, неспороносные.

Штамм хорошо растет на обычных питательных средах (МПА, МПБ, LB-бульон и LB-агар). При росте на мясопептонном агаре или LB-агаре колонии гладкие, круглые, прижатые, блестящие, мутные. При росте в жидких средах: в МПБ-бульоне или LB-бульоне образуют ровную интенсивную муть.

Физиолого-биохимические признаки.

Клетки растут в пределах от 4 до 50^оС, оптимальная температура роста 37^оС, оптимум pH 6,8-7,4.

В качестве источника углерода используют многие углеводы, спирты, органические кислоты, в частности альфа-глюкозу, альфа-фруктозу, галактозу, арабинозу, лактозу, трегалактозу.

В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной и нитратной форме, так и в органической форме в виде пептона, аминокислот.

Нитраты восстанавливают до нитритов.

Желатину не разжижают.

Индол не образуют.

Условия хранения штамма.

Штамм бактерий Escherichia coli ВКМ В-2007Д хранят на чашках и косяках. Пересевы на свежие среды один раз в месяц. Может храниться не менее года в 15%-ном глицерине при -20-70^оС, в лиофильно-высушенном состоянии с сахарожелатиновым агаром или в полужидкой агаризованной среде LB под вазелиновым маслом.

П р и м е р 1. Тестирование ферментов рестрикции. Для поиска рестриктаз использовали экспресс-метод, представляющий собой модификацию метода Белавина и соавт. [6] для этого одну-две большие колонии (около 5х10⁶-1х10⁷ клеток) суспендируют в 20 мкл буфера А (20 мМ трис-HCl, pH 7,6, 12,5 мМ ЭДТА, 100 мМ NaCl, 10 мМ 2-меркаптоэтанола), содержащего 10 мг/мл лизоцима, и инкубируют при комнатной температуре (18^оС). Через 30 мин добавляют равный объем буфера В (20 мМ трис-HCl, pH 7,6, 2% тритон Х-100, 10 мМ 2-меркаптоэтанола) и инкубируют еще 60 мин при 4^оС. Клеточную суспензию (1 и 4 мкл) смешивают с 2 мкг ДНК фага ⊘ 80 vir в 40 мкл буфера C (10 мМ трис-HCl, pH 7,6, 10 мМ MgCl2, 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 50 мМ NaCl). Гидролиз проводят при 37^оС в течение 10 мин. Кроме того, 4 мкл клеточной суспензии дополнительно инкубируют в 40 мкл буфера С без субстрата с целью проверки возможного наличия в растворе экстрахромосомной ДНК. Реакцию останавливают экстракцией равным объемом водонасыщенного фенола. Для электрофоретического анализа используют 20 мкл гидролизата.

П р и м е р 2. Получение и очистка рестриктазы.

Культуру клеток E. coli 75k выращивают в 1 л LB-бульона (5г дрожжевого экстракта, 10 г NaCl, 10 г бактотриптон на 1 л воды) при 37^оС до титра 4х10⁹ кл/мл. Клетки осаждают центрифугированием (6000 об/мин 15 мин). 1 г сырой биомассы суспендируют в 5 мл буфера, содержащего 10 мМ трис-HCl, pH 7,5, 150 мМ NaCl, 10 мМ ЭДТА, 10 мМ 2- меркаптоэтанола. Клетки разрушают ультразвуком, экстракт получают центрифугированием при 2^оС (48000g).

Для определения активности рестриктазы Eco75kI готовят серийные разведения супеpнатанта: 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, 1/128 в буфере (10 мМ трис-HCl, pH 7,5, 50 мМ NaCl, 1,0 мМ ЭДТА, 7 мМ 2-меркаптоэтанол). В инкубационную смесь (9 мкл), содержащую 10 мМ трис-HCl, pH 8,0, 10 мМ MgCl 2, 1 мМ ЭДТА, 1,0 мМ ДТТ, 1 мкг ДНК фага лямбда, добавляют 1 мкл соответствующего разведения экстракта и инкубируют при 37^оС в течение 1 ч. Результаты гидролиза проверяют с помощью электрофореза в 0,8%-ном агарозном геле.

За единицу активности берут количество фермента, необходимое для полного специфического расщепления 1 мкг ДНК фага лямбда в течение 1 ч.

Уровень активности рестриктазы Eco75kI, определенный в бесклеточном экстракте штамма E. coli 75 k, около 200000 ед. в пересчете на 1 г биомассы.

Рестриктаза Eco75kI может быть очищена фракционированием клеточного экстракта на колонке с DEAE-целлюлозой (DE-52 Whatman) с последующей хроматографией на фосфоцеллюлозе P-11 (Whatman), ДНК-агарозе [7] и гидроксилапатите. Препарат фермента окончательно концентрируют при диализе против бефера 50 мМ NaCl, 10 мМ трис-HCl, pH 7,5; 1 мМ ЭДТА; 7 мМ 2-меркаптоэтанол; 50% глицерин. Выход очищенного фермента составляет 4000 ед/г биомассы клеток.

Очищенный фермент стабилен при -20^оС в течение полугода. При 0^оС фермент сохраняет 95% своей активности в течение 2 недель, при 25^оС сохраняет 90% активности в течение 4 дн и при 65^оС теряет 95% активности в течение 15 мин. Рестриктаза пригодна для анализа структуры ДНК и для молекулярного клонирования.

П р и м е р 3. Определение последовательности нуклеотидов, узнаваемой рестриктазой Eco75kI, и места гидролиза ДНК.

Для определения последовательности узнавания рестриктазы проводят сравнение величин длин фрагментов, по- лученных экспериментально при гидролизе ДНК фага лямбда рестриктазой, с величинами длин фрагментов, рассчитанных на ЭМВ по соответствующим программам для различных последовательностей нуклеотидов. Была обнаружена только одна последовательность -5'-GPuGCPyC-3', для которой рассчитанные величины фрагментов совпадали с экспериментальными и были локализованы в следующих районах: 586, 10091, 19766, 21575, 24777, 25882, 39458.

Для подтверждения полученных данных проводят картирование участков узнавания рестриктазной Eco75kI на ДНК pBR322, используя совместный гидролиз с рестриктазами BamHl и SalI. Показано, что рестриктаза Ecо75kI гидролизует эту ДНК в позициях 476 и 490.

Для определения места гидролиза ДНК рестриктазой Ecо75kI была использована ДНК M13tg 130. После отжига с универсальным синтетическим праймером и реакции полимеризации матрицу обрабатывают эндонуклеазой рестрикции Eco75kI. Часть пробы вторично подвергают полимеризации и оба полученных препарата исследуют в условиях, предложенных Сэнгером, с использованием 8%-ного денатурирующего полиакриламидного геля, что позволило определить место гидролиза.

Полученные опыты позволяют сделать однозначный вывод, что рестриктаза Eco75kI является истинным изошизомером рестриктазы Banll и узнает и расщепляет последовательность нуклеотидов ДНК:
5'-GPuGCPy!C-3'
Кроме того, полученная рестриктаза Eco75kI характеризуется следующими оптимальными условиями реакции: pH для действия рестриктазы 7,5; температура действия 37^оС.

Таким образом, полученный штамм E. coli ВКМ В-2007Д, как продуцент специфической эндонуклеазы Eco75kI, обеспечивает высокий уровень содержания фермента не менее 200000 ед/г сырого вещества биомассы клеток, что достаточно для получения рестриктазы в препаративных количествах. Выход очищенного фермента составляет 4000 ед/г биомассы клеток, что в 20 раз превышает выход известной рестриктазы Eco261, выделенной из штамма E. coli RFL26, являющегося прототипом предлагаемого штамма.

Использование: биотехнология - для получения эндонуклеазы рестрикции Есо 75 кI, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5′-GPuGCP_y!C-3′. Рестриктаза, продуцируемая предлагаемым штаммом, является изошизомером рестриктазы BanII и может найти применение в геноинженерных исследованиях. Сущность изобретения: предлагаемый штамм Escherichia coli ВКМ В-2007Д выделен из клинических изолятов (г.Киев) и обеспечивает высокий уровень содержания фермента не менее 200000 ед/г сырого вещества биомассы клеток. Выход очищенного фермента составляет 4000 ед/г биомассы клеток.

Штамм бактерий Escherichia coli ВКМ В-2007 Д-продуцент эндонуклеазы рестрикции Eco 75 kI.