Способ получения ферментного препарата для синтеза антивирусных веществ Советский патент 1991 года по МПК A01N63/00 C12N9/04 C12N7/04 

Изобретение относится к вирусологии, в частности к способу получения ферментного препарата для синтеза антивирусных веществ против возбудителей болезней растений.

Известен способ получения фермента олигоаденилатсинтетазы растительного происхождения из листьев растений табака, инокулиоованного вирусом табачной мозаики (ВТМ) или интерфероном, который состоит в том, что листья табака сорта,

обладающего сверхчувствительностью к ВТМ, инфииируют этим вирусом. Затем листовую ткань гомогенизируют а 0,01 М фосфатном буфере рН 7.6; экстракт обраба- гидратированным фосфатом кальция и наносят Hd колонку ДЭАЭ-челлюлозы. Несорбисуемую фракцию пропускают через коленку с дс РНК-агарозой.К связавшемуся с носителем ферменту добавляют 0,005 М АТФ и инкубируют 5 ч при 25°С. Продуктом реакции являются антивирусные вещества олигоаденилатнои природы.

l/lcno iMott.H/r i в кпче стве источника e,ir 1ен-гнс j имеет ряд не ,,с т, тю„ r т. ,c мл необходимо от- и i паззития гаг -и требуется - ыии /, еын « щивании 2 з riu,d х1 с/ О,

щивэнич рэ(течмь f v т Р- дополните i r т /до1 tie M.HJ н iur учение / г -гм l гя л н « активности on , ,„де1к пг гр . меняете- ЕН CPKHI,, рульнтный r-ovr бачной M.as,, и fbrMl го ргни-i 1ряет широкое иг. ьзо (. с иба

BTV ijBHSt .U.M I/ - Ii

пя огенов рч i плии ч/о венных кул Т7 ч эо 1 с к Р д ствие зыг ко там о с- и оа

ЧТИМ RMpvn - irf , ,lu ij r, HI-I-IH

тепличные L t -.v1 Е. i ж- . ь. r- тений ьяк ри е/1еи dKHMii HHOKVTH- рованных ricij)ii a r vt Lji,aiOjtht иг обеззарэливани. , . tmLipyM Hioi В процессе vinct %1 оовьни) В i 1рз, нии табака, н.точищ л гфоисходит и.-ччротмчация р ткани и на- коппение ht, ои5рог КОГИЧЗСТР вируга Методика с-к- нтивиру н ix с применении. з« ( инфиц рсва, ной ткани не ии пчает еозможнсгти гопада ния ВТМ в i r лемыг конечной |роду т

Испольэов иле uf з дефицитного IL/OI nciuHiucri и1 )П 1Э увеличив ei ь v1 лл.-югть ферпентп

Извеси и поссЬ голу-bHfq par.vite/.t иои олиюадвг .г .,,1Ч1етазы v lpi( тг бака кул гивирусК1Ыл in rJv ajCTrii этого способа л жнсиь вы тили вания кулыур клеток в стерильных услов1л ях и накопления большой ткани

Цельизо р еьия упчоще.н г т и получение фермек г тэго препа не содержащего вирус

На фИ1 1 по -оне/ ч омато -чФиивског разделение п|:од/ ° с , з /13й ) целлюлозе, н i ф /н /. чм1ИБ -ч vf- ая тнр

ЧО Тп Г )Г у i С - / i JHv1 И ,X

дикого кa Dvfrei il F 1) н 1 и /мость актионос -i a-i «ивус.си х сидчне ний от концентоации препарат н& Л1 стьчл М сот1япа glut osa

Получение ферментного егырспа включает следующие этапы выращивзн1 -- исходных растений картофеля ( ферментной акгивио ти путег иникуля ии. X Y- вирусов картофеля или по тго очлечи экстракта и «..орсчию t,i цер л,гт, ся в нем фермент на аффунс-ч сг рпентг Полученный ферменгчы, пред ставляе1 . фро/тнт i ) г м -Ч синтета./) мм . л v 1-кл н

цс JHK- РГЛЮЛОЗР, ) ,y ,уется ( пс и | г г и i ( / чт uvc BriT ц i ° r I u нрще тоа

I lUi i fi TUI oT I- РИ с

i и-i ( г . - MI т j) течии и ко- TIL IL u-1 of vV r Mi1 i, L 4e

ч и - iv ч / Ф оме -ч- vo

ila r Г чпипу u-e n ч r n/- i -;), i i p

ft i (t-Htji rj,9r J Ч у (и IVt H (jy

kj , n/in-iHi ) n i г a о iii,m ри 11 д( « гч, j po- . i .и рл-jt « тд к.а r „ -а)0

i - i В t, /10ЛИ Г

P 10 Ik-, м Пу Р d ip ИТ n.iOII r

1 I i РГ рЛГиГ i v6 db С i

) bT U м к И Г) I й- If1 ЛТ 1 ,, Г v К iv I , , „ip, iров

-, м К .- О ч M i r M 1Г с f i f f и f V. к С i (J D1 M 2 мер к-iir 1чнола i 10°/ i церина (ПН 6( VupSKT r петляю н н р иугиоованир.1 (lOf OC g 1l ) и Нслюсят ч миксс1 ИОО ПО .у, , дсРНК м - i юзь Несорби- j Ba jiiiH s MaiPu i отмывают 002 Ni гои-: hTl , ГН / j

Meai- ( ,oh;vu , ii , ь остоит из 0,005 M

m n Q-, M MgSO i 0 2 IV, -рис-НС рН

7 6 подают nri кол нку го скоро) i тью мл ч поод/кты рракции с V -эстиf-n (ft pnTTj )1,м1изоея,шого на

ropui ЧТР i ц О а иЛИГОЯпрн, Т ЭТЬ

i оклада, -о скг1 м

i 1,ч v ие дсэьч i/r.o.

ij |-ис ,Р rt e,( куц-, цстпклк.зу прг i vibajTfl yv s- лпир и вс)0й утэняюг ежио масти. -i с nor1 пекан -ац и зчгем тилов м спиртом и выc/rj(nnao i г пипоь i a i .r-п смеши- с hv(/ и ui M фатного буфера рН 7 6 и ; ох ид его MI /мл пол1/ г-опи Ц vi 05 мг м/-, ЭПТА ГУСТУЮ v. , j Ч, I f Г 1Г С t1 i i 1 U191 Me

/iv ч , с ч им ,. i °ri vs и , -nt. 1 Уч. jjf ны оем or

4 ,тн )л )« , ,hOt fiflK n 1Ц|,-;нои V т- fi лиолеюной i пои мин с оз то- яиия 50 , h- пос/те w паррнич тирга про

Мг ваЮТ и 1 11 ХЛООИДЧ .

О )ТИВИ Г ),HBHOr ,.

j, ii .Д Ik I d Г s.

С f Г r Л Ч Г f i- н, П I t ( .1 i d Ml Г, О L i ч П

u i b Зчг-л аоль cj-гцн жилки

Ss Ь , s i П( ЛОЕ iMC K HrTriT ПТ 5 VK рЭ i, 3, r u i J№ о р э n aotidi -«и d Ару о w &Ъ M 1 ,з ча.сгог,гл vieioia .. vi I j , H ieppi Z u it с i jv ,, i j l иьге4 i т-,4 M i or oi

число некрозов. Антивирусную активность зьнисляют по формулам

Не Но

Н- X iOO % , если Ис Н0 ,

Н- - А 100 % . пг. Но,

rii i .- - 1;сло it,4 jo308 на пшювинкэ лис ч обработанло« о стандзптным растрором; Н0 - tflC ibiTyews..,. энтивиг / ным веществом.

В рчдэ ога- тов svcvo неьроз -в преобра по формуле

Н Ч0/Нсх Не

ер

где Нс - среднее число не/розов на листьях, обработанных стандартным раствором

8 таблицах и на рисунках приведены средние значения антивирусной активности или преобразованного чи.;ла некрозов и доверительный интервал и.ми наименьшее существенное оапличи-j (НСР) при 5%-ной вероятности пи и зки В других случаях (ТЕ-1) о инфицирований и УВК испытуемый и стандартный растворы наносят на противолежащие доли сложного листэ рзсгеж я-индикатора,

3 табл 1 представлены резупьтать1 сравнения активности олигоэденилатсин- из листьев картефтлч и табака, инду- цирэванных соответственно ХВК и ВТМ. Солее высокая антивирусная активность получена при использовании фермента кар тоФеля иммунного сорта.

Использование растений кашсфеля в возрасте 1 месяца связано с тем, что более молодые растения ке успевают нгбрзть до- стзточкэе количество листовой массы. Этот всзраст соответствует фазе начала бутонизации. В дальнейшем увеличение коли- листьев замедляется, поскопьку энергетические ресурсы растительного организма переключаются на накопление клубней, поэтому выращивание дольше 1 месяца не является целесообразным. Кроме того, после цветения листья грубеют, в условиях теплицы возможно их значительное от- ммрание.

Инфвичуюнность индуцирующего вируса бы :э эыбрзна со значительным избытком по Сузвнзни-с г уровнем, необходимым для инфмцсфоэан -гя аослриимчивого растения (обычно 10-50 мкг/ил) Использование дурмана в качестве накопителя Х-вируса картофеля, как правило,обеспечивает концентрацию вируса в листовом экстракте (1:10) не менее 500 мкг/мл (по данным иммунофер5 ментного анализа).

Использованная концентрация дсРНК (10 мкг/мл) близка к обычно используемым длп инфицирования концентрациям очищенных вирусных препаратов (например,

0 10 50 мкг/мл для ВТМ), Данных о влиянии вели -. ны молекулы дсР Hk на индукцию ин- тер реронопо,о5ных белков im i слигоаде- нилагсичтет.чзы в растительном српнизме не обнаружено, 8 животных тканях величиn нз пвуспираяьно; участка, необходимая для aKH ioipcMahiit ол1-1гоаденилатсинтрта- , |, состэрляс Т не менее 10 нукл птчдчы.х

ПЗ)),

Точная структура рчстительнь г,лигоа- 0 дени.чатов че устансвтеня.

Время сорбции фермента ня дсРНК носителе составляет 24ч. Ьмкость носителя (количество белка, элюируемою с дсРНК- цеп юлозы 1 Мэ аноламинзцетатным буфе- 5 ром рН 7,6) составила 1 5 2 wr/r сырого сорбента.

Пример /НнРмика изменения активности олигоа, 1и,атс1,тетазы картофеля после инокулрц s Х- и Y-вирусами и 0 дсРНК.

Способ получения препарата описан в призере 1 Результаты опыта приведены в тзбп.2 Высокие значения ак;взмости фермента получены «же ереэ 24 ч пс- .ле иноку- 5 у.яции индуктора. В случае применения вирусов активност, фе.рментною препарата сохраня пс крайней мере 7 дней. Индукция дсРНК столь же эффективна после 24- часового инкубационного периода, однако в 0 последующие дни НРСКОГЬКО снижается.

Гример 3 Выяснение природы веществ, синтезируемых из АТФ з присутствии ферментативного препарата картофеля.

5Для этого проводят хроматографию

продуктов реакции на колонке ДЗАЭ-цел- люлозы (2 с.i длима, 1 см диаметр/ Нуктео- тиды элюируют градиентом концентрации хлорида натрия (0 1 (V), На хроматограмме

0 реакционной смеси(фиг.1), инкубированной в присутствии фермента из инфицированных Т растений,заметно появление четы- TLX поьых соединений, три из KJTOPSIX vifriri -от антивирусной активностью по

5 крс пн и мере на од ,ом из примененных рг.ст .нии-индикаторов. Синтезируемые соединения элюируются растворами хлорида натрия большей концентрации, чем АМФ и АТФ, следовательно, отрицательный заряд

этих веществ больше, чем у АТФ. Аналогичные результаты получены и при разделении продуктов синтетазы, индуцированной дсРНК. Совпадение с ранее известными данными исследования соединений, синтезированных ферментом табака, свидетельствует о близости их свойств.

На фиг.2 представлены концентрационные зависимости антивирусной активности некоторых соединений, выделенных ионообменной хроматографией. Полученные данные свидетельствуют о высокой антивирусной активности продуктов реакции в концентрации 0,2-0,3 мкМ и более.

Пример 4. Сравнение активности препаратов, полученных с помощью ХВК и дсРНК.

Для этого проводят:

1.Получение иммобилизованного на дсРНК-целлюлозе фермента из листьев картофеля сорта Сафир. Испытывают следующие варианты инокуляции растений: соком дурмана, содержащим ХВК; 10 мкг/мл дсРНК (поли И-поли Ц); 0,01 М фосфатным буфером рН 7,6 (контроль). На колонку с аффинным сорбентом наносили экстракты 2- 5 г листьев картофеля в равном количестве 0,02 М трис-HCI буфера с 0.003 М MgSCM, 0,1 М КС1, 0,01 М меркаптоэтанолом и 10%- ным глицерином.

2.Синтез антивирусных веществ из АТФ с использованием иммобилизованного фермента. Реакционную смесь (0,005 М АТФ и 0,01 М MgSCM, 0,02 М трис-HCI рН 7,6) наносят на колонку со скоростью 0,5 мл/ч. На выходе получают раствор, содержащий антивирусные вещества.

3.Испытание антивирусной активности полученных соединений на половинках листьев Nlkotlana glutlnosa, инфицированных ВТМ. На одну из половинок листа растения- индикатора наносят исследуемый препарат за 3,5 ч до инокуляции вируса, на другую - стандартный раствор (исходная реакционная смесь, содержащая АТФ). Через 3 сут подсчитывают число некрозов на опытной и стандартной половинках листа. С целью исключения влияния различий в чувствительности листьев индикаторного растения к вирусу вычисляют преобразованную величину числа некрозов для каждого листа по формуле

Н /Нст X НстСР,

ср

где Нет - среднее число некрозов на половинках листьев, обработанных стандартным раствором,

Н1 и Нет - число некрозов на половинках 1-го листа, обработанных соответственно

изучаемыми соединениями (Нх , Ндс , НК1 - варианты инокуляции ХВК, дсРНК, контроль) и стандартным раствором.

Антивирусную активность вычисляют по формуле

(Н-НО/Н.

Н - среднее число некрозов в вариантах

ХВКидсРНК, Нк-в контроле.

Для определения наличия Х-вируса картофеля в инокулированных растениях картофеля используют наборы для иммуно- ферментного анализа (ИФА) производства

НПО по картофелеводству и фирмы Берин- гер Маннхайм.

Полученные результаты представлены в табл.3.

Антивирусная активность синтезированных веществ с применением фермента, индуцированного ХВК, 47%, фермента, индуцированного дсРНК,57%. Исследование методом ИФА содержания ХВК в растениях картофеля, инокулированных инфекционным соком дурмана, показало отсутствие вируса.

Пример 5. Определение количества препарата, полученного из разных иммунных к ХВК сортов картофеля,

В качестве меры количества (активности) ферментного препарата взято количество синтезируемого ферментом-ве- ществ-олигоаденилатов.

Для определения количества веществ

1-5 мл реакционной смеси наносят на микроколонку с 0,5 мл ПЭИ-целлюлозы (Sen/a, ФРГ), уравновешенной 0,02 М трис-HCI буфером рН 7,6. Колонку промывают 0,5 М хлоридом натрия в том же буферном растворе до значений Е260 меньше 0,01.

Олигоаденилаты элюируют 1 мл 1 % HCI и измеряют оптическую плотность Е260 полученных растворов. Аналогичные процедуры осуществляют в контрольном варианте,

однако на колонку дсРНК-целлюлозы фермент не наносят.

Количество выделенных веществ (нМ в 1 мл реакционной смеси) служит мерой активности фермента,

0 Результаты представлены в табл.4.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что препарат из картофеля сорта Сафир, инокулированного Х-виру- сом картофеля, обладает наиболее высокой

5 активностью. Хорошие результаты получены при применении листьев картофеля сорта Адретта, инокулированных Y-вирусом картофеля, а также сорта Сафир при инокуляции УВК. При использовании растений сорта Пересвет активность фермента была

значительно выше, что, вероятно, можно объяснить неоптимальными условиями проведения реакции, однако и в этом случае активность фермента несколько повышалась в инокулированных вирусами X и Y растениях, В ранее проведенных опытах с использованием ферментного препарата из листьев дикого картофеля (ТЕ-1), инокулированных УВК, количество продукта реакции в 1 мл реакционной смеси составило 1,9 нМ, а индуцированная вирусом антивирусная активность - 29 % (при сравнении с ферментным препаратом из безвирусного контроля). Использованные сорта культурного картофеля обладают высокой полевой устойчивостью к вирусам, а сорта Сафир и Пересвет - иммунитетом к ХВК и УВК соот ветственно. Измерения методом иммуно- ферментного анализа через неделю после инокуляции вирусами листьев растений ис- следованных сортов наличия вирусов не показали,

Таким образом, предложенный способ при применении позволяет получить ферментный препарат, не содержащий вируса по сравнению с известными, и улучшить его качество.

Формула изобретения Способ получения ферментного препарата для синтеза антивирусных веществ, включающий инокуляцию растений вирусом, выращивание инфицированного растения, отбор листьев и получение из них экстракта, содержащего фермент, с последующей сорбцией фермента на афинном сорбенте, отличающийся тем, что, с упрощения способа и улучшения качества ферментного препарата, из растений используют иммунное к вирусам сорта кар- тофепя, а инокуляцию осуществляют X вирусом картофеля или двуспиральной РНК, причем растения выращивают в течение 1-7 суток, а из сорбентов используют дсРНК- целлюлозу.

Таблица 1

Изобретение относится к вирусологии, в частности к способу получения ферментного препарата для синтеза антивирусных веществ против возбудителей болезней растений. Целью изобретения является упрощение способа получения ферментного препарата и улучшение его качества. Получение ферментного препарата включает следующие этапы: выращивание исходных растений картофеля, индукцию ферментной активности путем инокуляции X-Y-вирусов картофаля, или дсРНК, приготовление экстракта листьев и сорбцию содержащегося в нем фермента на аффинном сорбенте. Полученный ферментный препарат представляет собой фермент (олигоадени- латсинтетазу). иммобилизованный на дсРНК-целлюлоэе, и характеризуется способностью синтезировать из АТФ вещества (олигоаденилаты), обладающие антивирусной активностью на листьях растений, которые можно обнаружить выделением на ДЭАЭ- или ПЭИ-целлюлозе. Полученный препарат характеризуется также способом выделения на афинном сорбенте - средством олигоаденилатсинтетазы и двуспираль- ной РНК (дсРНК). 3 ил., 4 табл. VI О О го

Индукция олигоаденилатсинтетазы на листьях картофеля

сорта Сафир Х-вирусом картофеля и табака Nlcotiana glutlnos; вирусом табгчной мозаики

Таблица 2

Динамика активности олигоаденилатсинтетазы картофеля

после инокуляции ХВК, УЗК, дсРНК (антивирусная активность

продуктов ферментативного синтеза)

НСРоос 20

Антивирусная активность соединений, синтезированных с применением ферментных препаратов

из картофеля

Нстср- 19,5

НСРо.05 9,8

Тзблицз4

Анализ ферментные- препаратов из различные со о ртр фел я

250

42

а/

Й/г. /

t

т -о -о

сз

и$ъем,мл

Фиг.1

Фиг.З х