Штамм вниигенетика-10-89-продуцент изолейцина Советский патент 1980 года по МПК C12D13/06 

цента, способного к прямому синтезу L-изолейцнна и обладающего более высокой продуктивностью на более простых по состаз и дешевых питательных средах. Предлагаемый штамм продуцент /--изолейшина Brevibacterium flavum ВНИИгенетика-10-89 находится на хранении в Музее промышленных культур института ВНИИгенетика под регистрационным номероу. В-1507. Новый штамм получен как мутант в результате селекции с «спользованием в icaчестве мутагенных факторо.в диэтилсульфата и М-метил-М-н,итро-н,итрозо,гуандина. Исходным штаммом для получения мутанта ВНННгенет«ка-10-89 служил штамм Вг. flavum 178, являющийся продуцентом L--iAэина и отличающийся от своего .исходного штамма дикого типа потребностью в гомосерИИе. На 1-ом этапе селекции клетк штамма 178 были обработаны парам;и Д1 этилсульфата и высеяны на агаризованную минеральную среду без гомосерина, после чего среди выросших .колоний ревертантов был выбран ;мутант № 96, утративший потребность в гомосерине и способность продуцировать L-лизин, но отличавшийся способностью продуцировать L-лейц.ин п L-изолейцин, примерно по 2 г1л каждой -из этих аминокислот. Мутант № 96 был использован для проведения 2-х следующих этапов селекции с прл.менением .нитрозогуанидпна как мутагена и аналога изолейцнна О-метил-треонина в качестве селективного фактора при ,кОНцентрац,иях последнего 5 мг1мл и 10 мг/мл на 1-ом и 2-о.м этапах Соответственно. В результате был выделен штамм ВНИИгенетика-10-89, требующий для роста подобно щтамму дикого типа Brevibacterium flavum только биот1ин и тиам.ин и отличающийся устойчивостью К ингибирующе,му действию 0-метил-треонпна. Свойства нового штам|Ма позволяют культив1ИроБать его иа простых по составу питательных средах, содерж.ащих зглеводы (глюкоза или сахароза), минеральный азот, минеральные соли, В1ИТаМИНЫ или их источники (iKOp.VIOBHO кондентраты), lia которых щтамм продуцирует L-изолекщш без примеси L-лекцима. Наиболее близким к рассматриваемому является щтамм того же вида микроорганизма Brevibaclerium flavum AORI-126 4. Отличительным свойством известного штамма является устойч;ивость к .ингиб :рующему действию i2-x аналогов - а-амлно-|5-океИВалериановой кислоте и О-1метилтреоиину. Этот штамм сравнительно с други.МИ (Известными аиалогоустойчивымч штаммами продуцирует наибольшее количество -изолейцина - 14,5 г/л на средах с глюкозой, минеральным азотом, минеральными солями, витамина и гидролизатом соевого беЛКа. Данный шта,мм ВНИИгенетика-10-89 на более простых по составу средах, не содержащих белкового гидролизата и следовательно более дешевых, способен продуипровать до 19 г/л L-изолейцина. Таким образом, предлагаемый шта.мм отЛИчается от .известного Следующими Пркзнаками: устойчивостью только к одному аналогу - О-метилтреонину; .методОМ селекции, включающим отбор первичного продуцента L-изолейцина среди прототрофлых резертантов штам.ма ауксотрофа по гомосер1ину; более высоки.м урозне.м образования Lизолейиина на более простых -по составу питательных средах. Штамм Вг. fiavum ВНИ.Игенети,ка-10-89 имеет следующую культ рально-морфологическую характеристику. Морфологические признаки. Клетки озальпые длиной 1.7-2,5 Л1км, бесспоровые, неподвижные, траммположительные. Культуральныв признаки. Мясо-пептокный агар (МПА). Ма 5-е сутки роста при 28° С образует колонии диаметром 3-4 мм, круглые с гладким краем, лбнтр приподнят в виде .конуса, поверхпость гладкая, блестящая, цвет желтовато-кремовый. Штрих на АША. На 2-е сутки рост умеренный, край гладкий, поверхность блестящая, 1плотпая, цвет л елтовато-1Кремовый. Рост по уколу в МПА. Умеренный, в основном на поверхности среды. Минеральная среда Гловера с глюкозой. Для роста ,необходпм биотин и тиамин. На 5-е сутки роста при 28° С образует колонии диаметром I мм, цвет светло-кремовый. Рост щтр1иха на 2-е сутки умеренный, плотный, .цвет светло-кремовый. КартОфель. На 4-е сутки роста при 28° С рост скудный, штрих желтого цвета, пигмента в среду не выделяет. Желатину не разжижает. Отношение к ИСточникам углеро.да. Хорошо растет на глюкозе, сахарозе, мальтозе, фруктозе, манкозе; слабее на галактозе, рамнозе, сорбозе, сорбите, ам.монийной и натриевой солях уксусной кислоты, этилоЗОМ Сгшрте; не использует лактозу. Отношение к ргсточникам азота. Ассим:илирует (NH4)2SO4, NH4C1 и мочевину. Для биосинтеза и накопления штаммом Bf. flavum. .ВНИИгенетика-10-89 L-изолейцина ирименяются питательные среды, в состав которых входят в .качестве источник углерода: углеводы (глюкоза или сахароза); М;гнеральный азот (предпочтительно аммоний сернокислый); неорганические СО-единения магния, фосфора и кальция; ростовые факторы - бпотин и тиамин, которые .могут быть заменены дестиобиотином и кормовым концентратом Bi2 соответственно. Процесс ферментации L-изолейцина .предлагаемым штаммом осуществляют в. аэробных условиях при 28-30° С з течен е 66-72 ч. Определение содержан|Ия L-изолейцкка в .культуральной жидкости проводят с помощью метода бумажной хроматографии в системе растворителей: бутанол - уксусная кислота - вода (4:1:1), а также методом тонкослойной хроматографии на пласткн.ках «Siiufol в системе растворлтело:;: этилацетат - изопропанол - аммиак - вода (20:20: 1,5:25). Пример 1. Культуру штамма Вг. flavum ВНИИгенетика-10-89 выращивают в течение 24-36 ч при 30° С на косяках с агаризоваиной средой Хоттингера. Затем петлей высевают в колбы (емкостью 750 ,ил) с 30-;100 мл посевной среды. В качестве посевной среды может быть использован мясо-пептонпый бульон или среда следующего состава, г/л: Сахароза (NH4)2S04 MgS04 КН2Р04 Кормовой .кол5,0 центр ат В12 Кукурузный 20,0 экстракт Водопроводная Осталь;ю-; вода Среду перед стерилизапией подщелачивают КОН до рН 7,8-8,0; рН после стерг:лизации 7,0-7,2. Все компоненты посевной среды, как и ферментационной, стерилизуют вместе в азтоклаве лр.и 0,5 атм в течение 30 мин. После ззсева .колбы устанавливают на круговую качалку (220-240 об/мин) и выращивают посевной материал пр.и 30° С 20-24 ч. Готовый посевной матер-иал вносят в кол:.честве 3-5% (по объему) в колбы (Xiзанной выще емкости) с 25 мл ферментациоЕНОЙ среды. Ферментационная среда имеет сЛ;-лу ощий состав, г/л: Глюкоза (NH4)2S04 КП2Р04 MgS04 Мел 200 (лкг) Внотин 300 (мкг) Тиамин Водопроводная Остальное вода После 72-х часов роста к льтуры з к льтуральной жидкости .накапливается 17.С L-изолейцина. Пример 2. Выращ.ивание посевного материала проводят как в примере 1. Состав ферментационной среды отличается от состава, пр.иведенного в примере 1, тем, что зДГ&сто 130 г.л глюкозы берут 100 г/л. а змесго 300 лкгл тиами:на - 5 г/л кормовэго концентрата Bi2. Послг 66-72 ; ферментации в культхральной жидкости накапливается 19,0 гл L-изолейцина. При м е р 3. Выращивание посевного материала цроводят как в примере 1. Состав ферментационной среды отличается тзм, что вместо 130 г/л глюкозы берут 1.30 гл сахарозы, а вместо 200 мкг1л биотина - 500 мквл десхиобиотина. После 72-х часов ферментаци.и в культ}ралькой жидкост; накапливается 17.3 г1л L-изолейцина. Пример 4. Выращиваице посевного :у атериала проводят, как указано в пр.имере 1. Состав ферментационной среды отличается тем, что .вместо 130 г/л глюкозы берут ЬЗО г .: сахарозы, вместо 200 мкг/л биот.ин.д - 500 мкг/л дестиобиотина, а вместо .300 л.(кг .г тиамина - 5,0 г/л кормового концентрата BIO. После 66-72 ( роста .культуры з культуральной жидкости накапливается 17.2 г л /1-изолейцина. Предло:кенный шта.мм характеризуется устойчивостью к ингибирующему действию Ь-мет.ил-треонина. способностью к прямому синтезу / -изолейцша без добавления в среду предшественников .и способен продуцировать до 19 с .л L-изолейцина. и 3 о о р е т е н и я Штамм Вгг-jibacierium flavttm BHIIIIгенетика-10-89 - продуцент L-.изолейцина. Хранится в промыщленных .культ .р ВНИИге:-:ет ка. регистрационный Л9 В-1507. Морфологические признаки. Клетки овальные длиной 1,7-2,5 мкм, бесспорозые. кгподвижные, граммиоложительные. Кулотуралоные признаки. Мясо-1Ивпто;-:ный агар (ЛША). На 5-е сутки роста при 28 С образует колон1 1; диаметром 3-4 ..;..;, круглые с гладкий краем, центр поиподнят в виде конуса, поверхность гладкая, блестящая. 1;вет :ччелтозато-кремозый. Рост штриха на 2-е сутки умеренный, край гладкий, поверхность блестящая, плотная, цвет желтозато-.кремовый. Рост по уколу yN epeHHbni, в основном на поверхности среды. Минеральная среда Гловера. Для росга необходим биоти.н .и тиами.н. На 7-е сутки роста при 28°С образует колонии диаметром 1 мм, светло-кремового цвета. Рос: ;:тр ;ха на 2-е сутки умеренный, край гладK.iii, цвет светло-кремовый. Ка.ртофель. На 4-е сутки желтого , пигмент ; Желатину не разжижает. Отнощение к источникам углерода. Хорошо растет на глюкозе, сахарозе, мальто

зе, фруктозе, маннозе: слабее ка ra.najiTCse, рамнозе, сорбозе, сорб.ите. а.цетате натр-кя и аммония, этиловом спирте; не ислользует лактозу.

Отношение к источ.н, азота. Ассимилирует хлористый, азотнокислый или сернокислый аммо.ний и мочевину.

Штамм Вг. flavum ВВЙИтенетика-10-59 характеризуется устойч1 вость:-о к )1нги5;1рующему действию О-метагл-треонина и способностью к прямому синтезу 1-)3-олейци.на

без добавления в среду предшсстзенниксз.

Источники информации, принятые ко внимание при экапертлае:

1.Патент США № 3058888. хл. 195-29, опублик. 1962.

2.Патент США № 3231478, кл. 195-29, опублик. 1966.

3. Патент США Х° 3767529, кл. 195-29, олублик. 1973.

4. Патент Японии № 51-6237, кл. С 12 D 13/06, опублик. 1976 (лрототип).