ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ НАКОПЛЕНИЯ СИБИРЕЯЗВЕННОГО МИКРОБА Российский патент 2003 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 

Изобретение относится к микробиологии, а именно к клинической микробиологии, наиболее эффективно может быть использовано для бактериологической диагностики сибирской язвы.

Сохранение природных очагов сибирской язвы, а следовательно, наличие высокой эпидемиологической опасности развития инфекционного процесса обуславливает необходимость совершенствования специфической вакцинопрофилактики как одного из главных способов борьбы с данным заболеванием (2, 4). В этой связи актуальны исследования по разработке питательных сред целевого назначения для накопления биомассы, полноценной в отношении содержания основных антигенов и выделения сибиреязвенного микроба.

В настоящее время для этих целей используют питательную среду на триптическом переваре, среду ГКИ (раствор Хенкса и бычья сыворотка) (3) и среду Теннесена (1).

Недостатком этих сред является то, что эти среды лабораторного изготовления, сложны в приготовлении, не стандартны, включают бычью сыворотку (среда ГКИ), эти среды не селективны, не содержат ингибитора сопутствующей микрофлоры и не используются для выделения культуры из патологического материала.

Наиболее близким решением задачи того же назначения к заявляемому изобретению по совокупности признаков является питательная среда для выращивания (накопления) бацилл, в том числе сибиреязвенного микроба, содержащая солянокислый гидролизат казеина (источник азотистого питания), экстракт кормовых дрожжей (ЭКД), магний сернокислый, натрий хлористый, молибдат аммония, перфтордекалин, дистиллированную воду, pH 7,3-7,4. Через 12 ч культивирования биомассу бацилл обеззараживают формалином, что рассматривается как фактор ингибирования сопутствующей микрофлоры (3).

К причинам, препятствующим достижению указанного ниже технического результата при использовании известной среды, принятой за прототип, является то, что питательная среда является слабо селективной средой, ингибирует сопутствующую микрофлору частично, что не позволяет выделить культуру в чистом виде при работе с клиническим материалом, что соответственно не позволяет получить биомассу сибиреязвенного микроба со стандартными антигенными и биологическими свойствами, что крайне необходимо в процессе производства иммунобиологических и иммунопрофилактических препаратов.

Задача предлагаемого изобретения - повышение накопительных, селективных свойств и стандартности среды.

Указанный технический результат при осуществлении изобретения достигается тем, что в качестве основного источника азотистого питания в предлагаемой среде используется питательный бульон для культивирования микроорганизмов (5), в качестве стимулятора роста - витаминный препарат "ЭКД", характеризующийся высоким содержанием аминокислот и комплекса витаминов (6), динатрий фосфат и натрий углекислый, придающий среде изотонические свойства. Среда дополнительно содержит в качестве ингибиторов сопутствующей микрофлоры триметоприм и полимиксин М сульфат при следующем содержании компонентов, г/л:
Питательный бульон для культивирования микроорганизмов - 22,0
Витаминный препарат "ЭКД" - 1,0
Динатрий фосфат, обезвоженный - 0,45
Натрий углекислый, безводный - 0,05
Полимиксин М сульфат - 0,025
Триметоприм - 0,025
Вода дистиллированная - До 1000 мл
Внесение в питательную среду дополнительно триметоприма и полимиксина М сульфата способствует полной ингибиции сопутствующей микрофлоры, тем самым создаются благоприятные условия для роста сибиреязвенного микроба.

Питательная среда обладает хорошими ростовыми и накопительными свойствами, эффективность накопления в 100 раз.

Время генерации, то есть удвоение массы культуры, от 40 до 60 минут. Среда сконструирована из отечественных, гостированных ингредиентов на основе питательного бульона для культивирования микроорганизмов, а также в состав среды входит витаминный препарат "ЭКД", имеющий промышленный выпуск на предприятии НПО "Питательные среды" (5, 6, 7).

Среду получают следующим образом:
Пример 1. В колбе с 900 мл дистиллированной воды последовательно растворяют следующие ингредиенты среды, взятые в количестве (минимальное): питательный бульон для культивирования микроорганизмов - 21,0 г, витаминный препарат "ЭКД" - 0,7 г, динатрий фосфат - 0,35 г, натрий углекислый - 0,04 г, объем дистиллированной воды доводят до 1000 мл. Среду доводят до кипения и кипятят 2 мин. Стерилизуют автоклавированием при температуре 121^oС в течение 20 мин, охлаждают до температуры 45^oС и стерильно вносят триметоприм - 0,020 г, полимиксин М сульфат - 0,020 г. Среду разливают в стерильные пробирки.

Пример 2 отличается от примера 1 тем, что в колбе с 900 мл дистиллированной воды последовательно растворяют следующие ингредиенты среды, взятые в следующих количествах (оптимальные): питательный бульон для культивирования микроорганизмов - 22,0 г, витаминный препарат "ЭКД" - 1,0 г, динатрий фосфат - 0,45 г, натрий углекислый - 0,05 г, объем дистиллированной воды доводят до 1000 мл. Среду доводят до кипения и кипятят 2 мин. Стерилизуют автоклавированием при температуре 121^oС в течение 20 мин. Охлаждают до температуры 45^oС и стерильно вносят триметоприм - 0,025 г, полимиксин М сульфат - 0,025 г, среду разливают в стерильные пробирки.

Пример 3. Оотличается от примера 1, 2 тем, что в колбе с 900 мл дистиллированной воды последовательно растворяют следующие ингредиенты среды, взятые в следующем количестве (максимальное): питательный бульон для культивирования микроорганизмов - 23,0 г, витаминный препарат "ЭКД" - 1,4 г, динатрий фосфат - 0,55 г, натрий углекислый - 0,06 г. Среду доводят до кипения и кипятят 2 мин. Стерилизуют автоклавированием при температуре 121^oС в течение 20 мин. Охлаждают до 45^oС и стерильно вносят триметоприм - 0,03 г, полимиксин М сульфат - 0,03 г, объм дистиллированной воды доводят до 1000 мл. Среду разливают в стерильные пробирки.

Каждый вариант среды получают отдельно. Микробную взвесь тест-штаммов засевают в пробирки с питательной средой, перемешивают, инкубируют при температуре 37^oС в течение 22±2 ч.

Результаты биологических показателей предлагаемой и известной сред представлены в таблице.

Из таблицы видно, что предлагаемая среда обладает высокими селективными свойствами по сравнению с известной, так как она ингибирует рост сопутствующей микрофлоры, что обеспечивает выделение сибиреязвенного микроба в чистой культуре. Известная же среда подавляет рост сопутствующей микрофлоры частично, что не позволяет выделить сибиреязвенный микроб в чистой культуре. А также предлагаемая нами сухая питательная среда - стандартная, состоит из гостированных отечественных ингредиентов, что позволяет практическим лабораториям при длительном культивировании сибиреязвенного микроба с целью получения биомассы получать стандартную апирогенную, полноценную в отношении основных антигенов биомассу сибиреязвенного микроба.

Представленные преимущества предлагаемой среды повышают эффективность диагностики сибиреязвенного микроба при бактериологических исследованиях клинического материала от животных и людей, а также сырья животного происхождения и объектов внешней среды. Среда проста в приготовлении, не содержит дефицитных компонентов и может быть широко использована в практических лабораториях.

Источники информации
1. Козлов Ю.А. Питательные среды М., 1950 г.

2. Шляхов Э.Н. Сибиреязвенная аллергия. Кишинев, 1968 г.

3. Патент RU 2053293, кл. С 12 N 1/20, 27.01.96 г.

4. Ургуев К.Р. Сибирская язва в Дагестане. Разработка питательных сред и микротестсистем. Махачкала, 1998 г.

5. Ф.С. 42-3520-98.

6. Ф.С. 42-386 ВС-91.

7. Химические реактивы и высокочистые химические вещества. Каталог М., "Химия" 1983 г.

Изобретение относится к биотехнологии и клинической микробиологии, наиболее эффективно может быть использовано для бактериологической диагностики сибирской язвы. Среда содержит в качестве стимулятора роста витаминный препарат "ЭКД", в качестве источника азотистого питания - питательный бульон для культивирования микроорганизмов, для придания изотонических свойств среды - динатрий фосфат и натрий углекислый ex tempore, в качестве ингибитора роста сопутствующей микрофлоры триметоприм и полимиксин М сульфат и воду дистиллированную. Преимущество предлагаемого изобретения состоит в том, что среда полностью ингибирует рост сопутствующей микрофлоры. Кроме того, среда обладает высокой чувствительностью и эффективностью накопления. 1 табл.

Питательная среда для накопления сибиреязвенного микроба, содержащая источник азотистого питания, источник витаминов на основе дрожжей, ингибитор сопутствующей микрофлоры и дистиллированную воду, отличающаяся тем, что она содержит в качестве источника азотистого питания - питательный бульон для культивирования микроорганизмов, а дополнительно для придания изотонических свойств среды - динатрий фосфат и натрий углекислый ex fempore, в качестве источника витаминов - витаминный препарат "ЭКД", а в качестве ингибитора роста сопутствующей микрофлоры - триметоприм и полимиксим М сульфат при следующем соотношении компонентов, г/л:
Питательный бульон для культивирования микроорганизмов - 21,0-23,0
Витаминный препарат "ЭКД" - 0,7-1,4
Динатрий фосфат - 0,35-0,55
Натрий углекислый ex fempore - 0,04-0,06
Триметоприм - 0,02-0,03
Полимиксин М сульфат - 0,02-0,03
Вода дистиллированная - До 1 ле