СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ БАКТЕРИЙ Российский патент 1997 года по МПК C12Q1/04 

Способ идентификации бактерий может быть использован в микробиологической практике и конкретно при лабораторной диагностике инфекционных заболеваний, микробиологическом исследовании объектов окружающей среды.

Известен способ биохимической идентификация бактерий (Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. Под ред. М.О.Биргера. М. 1982), заключающийся в изучении ферментативных свойств микробов (способности сбраживать углеводы разлагать белковые продукты). Для обнаружения этих свойств бактерий пользуются посевом их на дифференциально-диагностические среды (жидкие и плотные), содержащие вещества, в отношении которых микробы способны проявлять свою ферментативную активность. Основой таких сред является среда Гисса 1% пептонная вода, к которой добавляется индикатор и то вещество, которое должно разложить ферменты исследуемого микроба. Такими веществами являются углеводы (глюкоза, мальтоза, маннит, лактоза, сахароза, ксилоза, арабиноза, дульцит, рамноза и другие), дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК), аминокислоты, мочевина и другие вещества. Изменения реакции среды, наступающие в результате деятельности ферментных систем микробов, выражаются в изменении цвета среды после 24 ч культивирования посевов.

К недостаткам этого способа следует отнести:
1 большую длительность проведения исследований, достигающую 24 ч,
2 большую номенклатуру препаратов, используемых при исследовании,
3 высокую стоимость материалов, применяемых при исследовании,
4 большую трудоемкость.

Известен способ серологической идентификации бактерий (Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. Под ред. М.О.Биргера. М. 1982). Его проводят с чистой культурой и диагностическими сыворотками в реакциях агглютинации, преципитации и других. Однако такой способ идентификации бактерий очень трудоемкий и дорогой, так как требует изготовления большого количества диагностических сывороток различных серологических вариантов. Кроме этого, серологическая идентификация не приемлема для таких микроорганизмов, как стафилококки из-за обилия его серовариантов.

Известен способ фагоидентификации бактерий (Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. Под ред. М.О.Биргера. М. 1982), который основан на способности изучаемого микроба лизироваться соответствующим фагом. Для этого в две пробирки с бульоном засевают культуру определяемых микробов, в одну из которых добавляют фаг от 1 до 10 капель в зависимости от литической силы фага. Через 20-24 ч культивирования посевов в термостате учитывают по густоте роста (мутности) полное или частичное воздействие фага на бактерии по сравнению с ростом в контрольной пробирке.

К недостаткам данного способа следует отнести:
1 большую длительность исследования,
2 необходимость содержания музея фагов,
3 высокую стоимость исследований.

Наиболее близким по достигаемому техническому результату к заявляемому способу является способ идентификации бактерий (Vinas L.D.M, Loren J.G. Bermudes J. Analysis of microcalorimetric curves for bacterial identification. Can. J. Microbiol. 1987, 33, N1, p. 6-11.). Способ идентификации бактерий заключается в цифровой обработке микроколометрических кривых роста бактерий с помощью автоматизированной системы идентификации, в основе которого лежит культивирование бактерий при одних и тех же условиях. Коэффициент идентификации вычисляют с помощью компьютера по результатам оценки корреляции и анализа сходства параметров микроколориметрических кривых идентифицируемых бактерий и кривых сравнения, принадлежащих известным микроорганизмам.

К недостаткам этого способа следует отнести:
1 большую длительность процесса идентификации,
2 применение дорогостоящего оборудования,
3 использование большого количества питательных сред.

Целью настоящего изобретения является повышение разрешающей способности и снижение стоимости способа идентификации бактерий.

Указанная цель достигается тем, что в предлагаемом способе идентификации бактерии культивируют в жидкой питательной среде, измеряя динамику их развития фотоэлектроколориметрическим способом при охлаждении их в процессе культивирования до температуры 20-27^oC. Согласно изобретению в качестве критерия идентификации применяют тангенс угла наклона логарифмического участка кривой, прилегающего непосредственно к лаг-фазе, или тангенс угла наклона участка лаг-фазы, если он имеет прямолинейный характер.

Заявляемое техническое решение отличается от прототипа тем, что измерение динамики развития бактерий проводят при охлаждении их в процессе культивирования до температуры 20-27^oC, а идентифицируют бактерии по тангенсу угла наклона логарифмического участка кривой динамики развития бактерий, прилегающего непосредственно к лаг-фазе, или тангенсу угла наклона участка лаг фазы, если он имеет прямолинейный характер.

Эти отличия позволяют сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию изобретения "новизна". Признаки, отличающие заявляемое техническое решение от прототипа, не выявлены в других технических решениях при изучении данной и смежной областей техники и, следовательно, обеспечивают заявляемому техническому решению соответствие условию патентоспособности изобретательский уровень.

Осуществление заявляемого способа производится с помощью фотоэлектроколориметра типа КФК-2МП.

Методика измерения динамики развития исследуемых бактерий заключается в следующем.

Перед исследованием согласно инструкции по эксплуатации прибора проводится калибровка светового потока путем подбора кювет и светофильтров. Контрольная и опытная кюветы заполняются мясопептонным бульоном до метки на боковой поверхности, помещаются в кюветное отделение фотоэлектроколориметра и выдерживаются при закрытом отделении в течение некоторого времени, необходимого для установления в кюветном отделении и в объеме питательной среды определенной температуры. Температура контролируется при помощи термометра, помещенного в кюветное отделение фотоэлектроколориметра. Исследования проводятся в диапазоне температур 20-37^oC. После достижения необходимой температуры в опытную кювету микропипеткой вносится стандартная взвесь в физиологическом растворе отмытой от продуктов жизнедеятельности бульонной культуры исследуемых бактерий в объеме 0,2 мл на поверхность питательной среды без ее перемешивания. В контрольную кювету вносится 0,2 мл физиологического раствора. Кюветы стерилизуют смесью Никифорова в течение 30 мин непосредственно перед заполнением их мясопептонным бульоном, тщательно протирают от остатков смеси стерильным тампоном. Величину оптической плотности раствора определяют каждые 5 с на протяжении 3-4 ч при длине волны светового потока 540 нм. На основании полученных цифровых данных строятся кривые динамики развития исследуемых бактерий.

В основе предлагаемого способа идентификации лежит то, что микроорганизмы при культивировании их в одних и тех же условиях имеют определенную, специфичную для каждого вида скорость своего развития. Скорость развития бактерий в предлагаемом способе идентификации определяется по тангенсу угла наклона логарифмического участка кривой динамики развития бактерий, прилегающего непосредственно к лаг-фазе, или по тангенсу угла наклона участка кривой лаг-фазы, если он имеет прямолинейный характер. Специфичность этого свойства возрастает, если исследуемую культуру подвергнуть охлаждению в диапазоне температур 20-27^oC. При соблюдении этого условия резко возрастает и разрешающая способность предлагаемого способа и становится возможной идентификация бактерий не только на уровне рода и вида, но и на уровне штаммов. Охлаждение исследуемой культуры ниже 20^oC нецелесообразно, так как резко увеличивается длительность лаг-фазы, что в свою очередь удлиняет процесс идентификации до 10-12 ч.

Сущность предлагаемого способа идентификации бактерий заключается в следующем.

В процессе длительной эволюции свойства бактерий формировались в результате компенсаторных ответных реакций их на воздействия факторов окружающей среды. При этом приобретение новых свойств клеткой может происходить двумя путями: 1 за счет сообщения клетке новых видов энергии прежней интенсивности, 2 за счет увеличения интенсивности воздействия прежних видов энергии. В первом случае формируется большое количество однотипных механизмов компенсации (свойств) разного вида воздействий, но одинаковых по своей интенсивности, то есть одинаковых по количеству энергии, сообщаемой клетке. Во втором случае, а именно, при увеличении интенсивности воздействия прежних видов энергии на клетку происходит формирование принципиально новых механизмов компенсации этого воздействия, а, следовательно, и приобретение принципиально новых свойств клеткой.

Весь процесс возникновения новых свойств у микроорганизмов можно смоделировать графически в виде "дерева" (фиг. 1).

По плотности расположения механизмов формирования бактериальной клеткой свойств, моделируемых "веточками дерева" можно выделить несколько уровней энергии. Предположим, что последний (4) уровень (фиг. 1) соответствует современному энергетическому состоянию бактериальной клетки. Этот уровень будет характеризоваться наличием большого количества одинаковых механизмов жизнедеятельности (свойств) не только у бактерий разного вида, но и у бактерий разного рода. Процесс каждого эволюционного периода бактерий, то есть формирование каждого энергетического уровня у разного рода микроорганизмов в большинстве случаев проходил в одних и тех же условиях окружающей среды, что и привело к появлению на каждом энергетическом уровне у разных видов бактерий большого количества одинаковых свойств. В этом случае кроны их деревьев (свойств) смыкаются и процесс их идентификации становится затруднительным.

Например, всем известным является тот факт, что современные бактерии кишечной группы, такие как сальмонеллы, шигеллы, эшерихии, энтеробактерии и другие, имеют одни и те же морфологические свойства и представляют собой грамотрицательные палочки, имеют одни и те же культуральные свойства и на простых питательных средах дают округлой формы полупрозрачные колонии. Более совершенным методом идентификации этой группы бактерий является метод биохимической идентификации. Но и в этом случае порой довольно сложно идентифицировать их из-за обилия общих биохимических свойств.

Анализ графической модели существования свойств у клетки в зависимости от ее энергетического состояния(фиг. 1) показал, что процесс идентификации будет значительно облегчен, если его проводить на более низком энергетическом уровне клетки, который соответствует ее первичным, исходным, а потому фундаментальным свойствам. Проведение исследований на этом уровне возможно, если изъять каким-либо образом часть энергии от бактериальной клетки. В этом случае будет наблюдаться максимальное различие между бактериальными клетками, а, следовательно, и максимальная разрешающая способность методов, применяемых для их идентификации.

Осуществить развитие микроорганизмов на более низком энергетическом уровне практически можно путем понижения температуры их культивирования. При понижении температуры культивирования уменьшается тепловое движение на атомно-молекулярном уровне, что приводит к устранению тех однотипных механизмов жизнедеятельности (свойств), которые свойственны для более высокого энергетического состояния клетки.

Ниже приводится конкретный пример осуществления заявляемого способа.

В качестве исследуемых бактерий использовали музейные штаммы - Escherichia coli HB-101, рекомбинантный штамм E.coli HB-101, продуцирующий белок ВИЧ, E.coli K-12, Enterobacter aerogenes.

Результаты исследований представлены на фиг. 2, 3.

Из-за отсутствия устройства, реализующего способ прототипа, практическое сравнение результатов идентификации бактерий по предлагаемому способу было осуществлено с более доступным способом аналогом биохимической идентификацией, как наиболее распространенным среди группы приведенных выше бактерий.

Результаты биохимической идентификации исследуемых бактерий, проведенной с использованием тест-систем API-20, Enterotest и сред Гисса, представлены в таблице.

Из анализа кривых, представленных на фиг. 2, видно, что скорость размножения разных видов бактерий E.coli (кривая 1) и E.aerogenes (кривая 2) при одних и тех же условиях культивирования (37^oC) различна.

Скорость размножения бактерий определяется в данном случае по тангенсу угла наклона α начального логарифмического участка кривой динамики развития бактерий, непосредственно прилегающего к участку кривой, характеризующего лаг-фазу. Чем больше тангенс угла наклона этого участка кривой, тем больше скорость размножения бактерий. Тангенс угла наклона этого участка кривой динамики развития E.coli равен 7,8, а E.aerogenes 5,8.

Из анализа кривых, представленных на фиг. 3, видно, что скорость развития исходного (кривая 2) и рекомбинантного (кривая 1) штаммов E.coli HB-101 при обычных условиях культивирования (37^oC) одна и та же. Тангенс угла наклона a кривой динамики их развития в лаг-фазе равен 0, а в первой половине фазы логарифмического роста равен 6,8. Следовательно, в данном случае идентифицировать бактерий не представляется возможным. Биохимический способ также не приемлем в этом случае (см. таблицу).

Однако, если охладить исследуемые культуры в диапазоне температур 20-27^oC в процессе культивирования, то скорость размножения рекомбинантного штамма E. coli HB-101 в лаг-фазе резко возрастает. Тангенс угла наклонно a рекомбинантного штамма (фиг. 3, кривая 3) в этом случае равен 1,5, а исходного штампа 0 (фиг. 3, кривая 4).

Измерение скорости развития каждого вида бактерий определялось 20 раз. Погрешность измерений составляет 5-7%
Из анализа результатов сопоставления видно, что предлагаемый способ идентификации бактерий отличается от прототипов и аналогов:
1. Небольшой длительностью идентификации (3-4 ч).

2. Экономически более выгоден, так как не требует применения дорогостоящего оборудования, большой номенклатуры питательных сред, содержания музея фагов.

3. Обладает более высокой разрешающей способностью, позволяющей идентифицировать бактерии не только на уровне рода и вида, но и на уровне штаммовой принадлежности.

Использование: микробиология, в частности, при лабораторной диагностике инфекционных заболеваний, микробиологическом исследовании объектов окружающей среды. Сущность изобретения: в течение 3-4 часов проводят идентификацию бактерий по тангенсу угла наклона первой половины логарифмического участка фотоэлектроколориметметрической кривой динамики развития бактерий или по тангенсу угла наклона лаг-фазы, если она имеет прямолинейный характер; культивирование бактерий производят при охлаждении в диапазоне температур 20-27^oC, 3 ил, 1 табл.

Способ идентификации бактерий, включающий культивирование бактерий в жидкой питательной среде и измерение динамики их развития фотоэлектроколориметрическим методом, отличающийся тем, что измерение динамики развития бактерий проводят при охлаждении в процессе культивирования до 20 - 27^oС, а идентифицируют бактерии по тангенсу угла наклона логарифмического участка кривой динамики развития бактерий, прилегающего непосредственно к лаг-фазе, или тангенсу угла наклона участка лаг-фазы, если он имеет прямолинейный характер.