СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ БРУЦЕЛЛ Российский патент 1997 года по МПК C12Q1/04 C12N1/20 

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и касается способа идентификации бруцелл.

Известны способы идентификации бруцелл в серологических реакциях и по определению биохимических свойств, что требует значительных затрат времени и средств.

Предлагается способ идентификации бруцелл путем посева исследуемого материала на плотную питательную среду с последующим пересевом чистой культуры на жидкую питательную среду и сравнительного определения скорости роста в динамике, причем скорость роста определяют по степени светопоглощения, определение проводят в первые 5 суток роста, сравнивают кривые роста при 25^oC и 37^oC и при превышении скорости роста пропорционально времени при 37 ^oC относительно 25^oC идентифицируют бруцеллы.

Осуществимость способа подтверждается примерами.

Пример 1. Исследуемый материал (культуры бактерий, экскременты животных, измельченные кусочки тканей, органов, пробы кормов и т.п.) засевают на плотную питательную среду мясо-пептонный агар с добавлением 1% глюкозы и 2% химически чистого глицерина. При появлении на поверхности плотной питательной среды на 3-4 сутки инкубации мелких блестящих выпуклых с ровными краями и гладкой поверхностью полупрозрачных колоний их смывают в асептических условиях стерильным 0,1М фосфатным буферным раствором (pH 10,6-11,0), готовят суспензию и разводят по стандарту до 10 ед мутности. По 0,1 мл стандартной суспензии засевают стерильной пипеткой в 10 пробирок, содержащих 5 мл мясопептонного бульона с добавлением 1% глюкозы и 2% химически чистого глицерина. Нечетные пробирки инкубируют при 37^oC, а четные при 25^oC. Через 18-24 часа инкубации первую и вторую пробирки с посевами прогревают на кипящей водяной бане в течение 1 часа и замеряют на фотоэлектроколориметре КФК-2 оптическую плотность (Д) и коэффициент светопоглощения бульона (Т) при светофильтре 540, чувствительность 3. В качестве контроля используют незасеянную среду. Интенсивность помутнения бульона в пробирках при 37^oC и 25^oC замеряют с интервалом 24 часа и по полученным результатам строят кривые роста. Для построения кривых роста используют показатель степени светопоглощения, который определяется как 100% Г.

На фиг.1 показаны кривые роста Brucella abortus при 25^oC и 37^oC.

Как видно на фиг.1, для бруцелл характерно медленное нарастание степени светопоглощения в первые 3 суток роста с резким скачком соответствующего показателя на 4-5 сутки при температуре 37^oC относительно 25^oC.

Пример 2. На фиг. 2 и 3 показаны кривые роста Brucella abortus в сравнении с другими микроорганизмами Escherichia coli, Pseudomonas maltophylia, Salmonella enteritidis, Yersinia enterocolitica.

Как видно на фиг. 2 и 3, микроорганизмы обнаруживают характерные особенности роста по сравнению с бруцеллами.

Так, Eschrichia coli, Salmonella enteritidis интенсивно растут при температуре 37^oC с достижением максимума роста в течение первых 3 суток роста. У E.coli интенсивность роста при температуре 37^oC мало отличается от показателей роста при температуре 25^oC, у сальмонелл в первые 2 суток скорость роста при температуре 37^oC значительно выше, чем при температуре 25^oC.

У иерсиний при температуре 37^oC проявляется длительная лаг-фаза роста к концу 2-3 суток скорость роста ниже, чем в первые 18-24 часа роста, при температуре 25^oC показатели роста выше, чем при температуре 37^oC.

У псевдомонад скорость роста повышается медленно до 4-5 суток, со 2-4 суток показатели роста при температуре 25^oC или выше, чем при температуре 37^oC или одинаковы при обеих температурах.

Пример 3. Исследуемый материал (проба корма) суспендируют в 0,1М фосфатном буфере (pH 10,6-11,0) в отношении 1:5. Суспензии дают отстояться в течение 20-30 минут, засевают на жидкую и плотную питательные среды (мясопептонный бульон с добавлением 1% глюкозы и 2% химически чистого глицерина; мясопептонный агар с добавлением 1% глюкозы и 2% химически чистого глицерина соответственно), инкубируют при 37^oC. При обнаружении первичного посева на жидкой среде и отсутствии характерного роста на плотной среде из каждой пробирки готовят мазки, которые окрашивают по Граму, делают пересев на плотную питательную среду, культивирование проводят при тех же условиях, что и культивирование первичного материала. При появлении на поверхности среды характерного для бруцелл роста, культуру исследуют, как в примере 1.

Предлагаемый способ идентификации бруцелл испытан и подтвержден в серии экспериментов из 10 опытов. Выделение бруцелл подтверждено изучением их биохимических свойств и спектра жирных кислот клеточной стенки.

Предлагаемый способ позволяет идентифицировать культуры бруцелл до рода, проследить их циркуляцию во внешней среде, длительность пребывания в организме больных животных и у носителей, выявить источник и пути передачи инфекции. Основными преимуществами способа по сравнению с известными являются простота, доступность из-за отказа от дорогостоящих реактивов, необходимых для исследования биологических свойств бактерий общепринятым методом.

Использование: ветеринарная микробиология, биотехнология, идентификация бруцелл. Сущность изобретения: поводят посев исследуемого материала на плотную питательную среду, затем чистую культуру пересевают на жидкую питательную среду и определяют скорость роста в динамике по степени светопоглощения в первые 5 дней роста при температуре 25^oC и 37^oC и при повышении скорости роста пропорционально времени при температуре 37^oC относительно 25^oC идентифицируют бруцеллы. 3 ил.

Способ идентификации бруцелл путем посева исследуемого материала на плотную питательную среду с последующим пересевом чистой культуры на жидкую питательную среду и сравнительного определения скорости роста в динамике, отличающийся тем, что скорость роста определяют по степени светопоглощения, определение проводят в первые 5 дней роста, сравнивают кривые роста при 25 и 37^oC и при превышении скорости роста пропорционально времени при 37^oС относительно 25^oC идентифицируют бруцеллы.