СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ БАКТЕРИЙ Российский патент 1998 года по МПК C12M1/34 

Изобретение может быть использовано в микробиологической практике, и конкретно при лабораторной диагностике инфекционных заболеваний, микробиологическом исследовании объектов окружающей среды.

Известен способ биохимической идентификации бактерий (Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. / Под ред. Биргера М. О. , М., 1982), заключающийся в изучении ферментативных свойств микробов (способности сбраживать углеводы и разлагать белковые продукты). Для обнаружения этих свойств бактерий пользуются посевом их на дифференциально-диагностические среды (жидкие и плотные), содержащие вещества, в отношении которых микробы способны проявлять свою ферментативную активность. Основой таких сред является среда Гисса - 1% пептонная вода, к которой добавляется индикатор и то вещество, которое должно разложить ферменты исследуемого микроба. Такими веществами являются углеводы (глюкоза, мальтоза, маннит, лактоза, сахароза, ксилоза, арабиноза, дульцит, рамноза и другие), дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК), аминокислоты, мочевина и другие вещества. Изменения реакции среды, наступающие в результате деятельности ферментных систем микробов, выражаются в изменении цвета среды после 24 ч культивирования посевов.

К недостаткам этого способа следует отнести:
- большую длительность проведения исследований, достигающую 24 ч;
- большую номенклатуру препаратов, используемых при исследовании;
- высокую стоимость материалов, применяемых при исследовании;
- большую трудоемкость.

Известен способ серологической идентификации бактерий (Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования./ Под ред. Биргера М.О. М., 1982). Его проводят с чистой культурой и диагностическими сыворотками в реакциях агглютинации, преципитации и других. Однако такой способ идентификации бактерий очень трудоемкий и дорогой, так как требует изготовления большого количества диагностических сывороток различных серологических вариантов. Кроме этого, серологическая идентификация не приемлема для таких микроорганизмов, как стафилококки из-за обилия его серовариантов.

Известен способ фагоидентификации бактерий (Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. / Под ред. Биргера М.О. М., 1982), который основан на способности изучаемого микроба лизироваться соответствующим фагом. Для этого в две пробирки с бульоном засевают культуру определяемых микробов, в одну из которых добавляют фаг от 1 до 10 капель в зависимости от литической силы фага. Через 20-24 ч культивирования посевов в термостате учитывают по густоте роста (мутности) полное или частичное воздействие фага на бактерии по сравнению с ростом в контрольной пробирке.

К недостаткам данного способа следует отнести:
- большую длительность исследования;
- необходимость содержания музея фагов;
- высокую стоимость исследований.

Наиболее близким по достигаемому техническому результату к заявляемому способу является способ идентификации бактерий (Vinas L.D.M., Loren J.G., Bermudes J. Analysis of microcalorimetric curves for bacterial identification. - Can. J. Microbiol., 1987, 33, N 1, p. 6-11). Способ идентификации бактерий заключается в цифровой обработке микроколориметрических кривых роста бактерий с помощью автоматизированной системы идентификации, в основе которого лежит культивирование бактерий при одних и тех же условиях. Коэффициент идентификации вычисляют с помощью компьютера по результатам оценки корреляции и анализа сходства параметров микроколориметирческих кривых идентифицируемых бактерий и кривых сравнения, принадлежащих известным микроорганизмам.

К недостаткам этого способа следует отнести:
- большую длительность процесса идентификации;
- применение дорогостоящего оборудования;
- использование большого количества питательных сред.

Целью изобретения является снижение длительности и стоимости способа идентификации бактерий.

Указанная цель достигается тем, что в предлагаемом способе регистрируют фотоэлектроколориметрическую кривую процесса диффузного распределения бактериальных клеток в замкнутом объеме жидкой среды при наличии градиента концентрации. Согласно изобретению в качестве критерия идентификации используют время исчезновения градиента концентрации при заданном объеме жидкой среды и вносимого в среду инокулята.

Заявляемое техническое решение отличается от прототипа тем, что в качестве критерия идентификации используют время исчезновения градиента концентрации бактериальных клеток в жидкой среде.

Эти отличия позволяют сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию изобретения "новизна". Признаки, отличающие заявляемое техническое решение от прототипа, не выявлены в других технических решениях при изучении данной и смежной областей техники и, следовательно, обеспечивают заявляемому техническому решению соответствие условию патентоспособности "изобретательский уровень".

Осуществление заявляемого способа производится с помощью фотоэлектроколориметра типа КФК-2МП.

Методика измерения процесса диффузного распределения бактерий в жидкой среде заключается в следующем.

Перед исследованием согласно инструкции по эксплуатации прибора проводится калибровка светового потока путем подбора кювет и светофильтров. Контрольная и опытная кюветы заполняются мясопептонным бульоном до метки на боковой поверхности, помещаются в кюветное отделение фотоэлектроколориметра и выдерживаются при закрытом отделении в течение некоторого времени, необходимого для установления в кюветном отделении и в объеме питательной среды определенной температуры. Температура контролируется при помощи термометра, помещенного в кюветное отделение фотоэлектроколориметра. Исследования проводятся в данном случае при 30^oC. После достижения необходимой температуры в опытную кювету микропипеткой вносится стандартная взвесь в физиологическом растворе отмытой от продуктов жизнедеятельности бульонной культуры исследуемых бактерий в объеме 0,2 мл на поверхность питательной питательной среды без ее перемешивания. В контрольную кювету вносится 0,2 мл физиологического раствора. Кюветы стерилизуют смесью Никифорова в течение 30 мин непосредственно перед заполнением их мясопентонным бульоном, тщательно протирают от остатков смеси стерильным тампоном. Величину оптической плотности раствора определяют каждые 5 с на протяжении 15-60 мин при длине волны светового потока 540 нм. На основании полученных цифровых данных строится кривая процесса диффузного распределения бактериальных клеток в жидкой среде и рассчитывается коэффициент диффузии. Согласно II закону Фика коэффициент диффузии связан с расстоянием и временем.

где C_o - концентрация бактерий в объеме инокулята;
C_x,t - концентрация бактерий, зависящая от координаты;
x - расстояние, пройденное бактериальной клеткой от поверхности среды в направлении уменьшения градиента концентрации;
t - время исчезновения градиента концентрации;
D - коэффициент диффузии.

Поскольку коэффициент диффузии определить довольно сложно с помощью современных методов, поэтому в качестве критерия идентификации бактерий использовали время исчезновения градиента концентрации, то есть время установления постоянной величины оптической плотности исследуемого раствора.

В основе предлагаемого способа идентификации лежит механизм диффузного распределения частиц в замкнутом объеме жидкой среды.

Сущность предлагаемого способа идентификации бактерий заключается в следующем.

С классической точки зрения механизм диффузного распределения частиц осуществим при выполнении двух условий: 1 - наличие градиента концентрации, 2 - наличие теплового движения.

Убитая микробная клетка представляет собой объект, близкий к твердому телу, то есть является частицей, обладающей только тепловым движением. Каждый вид микроорганизмов имеет свои морфологические признаки, такие как размеры бактериальной клетки, форма, которыми определяется характер сопротивления окружающей среды при тепловом перемещении микробных клеток. Иначе говоря, каждый микроорганизм должен обладать своей индивидуальной скоростью теплового перемещения в объеме жидкой среды при наличии градиента концентрации. Следовательно, время исчезновения градиента концентрации является индивидуальным признаком для каждого вида микроорганизмов и может служить критерием их идентификации, если исследования проводить при неизменности таких параметров, как состав и однородность среды, pH, температура среды, возраст инокулята исследуемой культуры, доза инокулята. Выполнение этих условий с технической точки зрения представляет собой достаточно легкую задачу.

Что же касается живых микроорганизмов, то они также могут быть приняты в качестве неживого объекта в начальный период своего развития, который в литературе описывается как период диффузного распределения бактериальных клеток (Колпакова С.Д., Колпаков А.И. Исследование особенностей механизмов развития бактерий в лаг-фазе. - Бюл. экспер. биологии и медицины, 1994, N 3, с. 331-336). Однако живые микроорганизмы помимо теплового движения могут иметь индивидуальный механизм своего перемещения в питательной среде даже при отсутствии градиента концентрации, обусловленный наличием у них органов передвижения - жгутиков, ресничек, осевых нитей и т.д., которые определяют индивидуальный характер их движения. Характер и скорость перемещения бактериальной клетки в питательной среде в данном случае определяется количеством жгутиков, местом и характером их расположения. В связи с этим у живых подвижных микроорганизмов, обладающих высокой индивидуальной скоростью передвижения, не всегда удается зарегистрировать период диффузного распределения, а следовательно, определить время исчезновения градиента концентрации. Но при наличии соответствующего оборудования предлагаемый способ идентификации станет приемлемым и для данной группы микроорганизмов.

Ниже приводится конкретный пример осуществления заявляемого способа.

В качестве исследуемых бактерий использовали музейные штаммы - Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, Salmonella choleraesuis.

Результаты исследований представлены на фиг. 1, 2.

Из-за отсутствия устройства, реализующего способ прототипа, практическое сравнение результатов идентификации бактерий по предлагаемому способу было осуществлено с более доступным способом - аналогом - биохимической идентификацией, как наиболее распространенным среди группы приведенных бактерий.

Результаты биохимической идентификации исследуемых бактерий, проведенной с использованием тест-систем API - 20, Enterotest и сред Гисса, представлены в таблице.

На фиг. 1 представлены кривые процесса диффузного распределения убитых, а на фиг. 2 - живых микробных клеток E. coli (кривая 1), E. aerogenes (кривая 2), S. choleraesuis (кривая 3).

Из анализа кривых, представленных на фиг. 1, видно, что, во-первых, характер диффузного распределения у разных видов бактерий различен. Во-вторых, различно время исчезновения градиента концентрации в объеме рабочего раствора, то есть время установления постоянного значения оптической плотности. Например, для E. coli время установления постоянного значения оптической плотности равно 40 мин, для E.aerogenes - 60 мин, для S. choleraesuis - 30 мин.

Что же касается живых бактерий тех же видов, то анализ представленных на фиг. 2 кривых показал, что время исчезновения градиента концентрации также различно для каждого из указанных видов, хотя и значительно сокращается. Например, время исчезновения градиента концентрации для E. coli равно 12 мин, для E. aerogenes - 8 мин, для S. choleraesuis - 5 мин.

Измерение процесса диффузного распределения бактерий каждого вида в жидкой среде определялось 20 раз. Погрешность эксперимента составляет 5-7%.

Из анализа результатов сопоставления видно, что предлагаемый способ идентификации бактерий отличается от прототипа и аналогов:
1. Небольшой длительностью процесса идентификации (15-60 мин).

2. Экономически более выгоден, так как не требует применения дорогостоящего оборудования, большой номенклатуры питательных сред, содержания музея фагов.

Использование: изобретение относится к микробиологии и может быть использовано при лабораторной диагностике инфекционных заболеваний, а также микробиологическом исследовании окружающей среды. Сущность изобретения: определяют фотоэлектроколориметрическую кривую процесса диффузионного распределения бактериальных клеток при наличии градиента концентрации. По величине времени исчезновения градиента концентрации судят о виде бактерий. 1 табл., 2 ил.

Способ идентификации бактерий, включающий регистрацию фотоэлектроколориметрической кривой процесса диффузного распределения бактериальных клеток в жидкой среде при наличии градиента концентрации, по которой идентифицируют бактерии, отличающийся тем, что в качестве критерия идентификации используют время исчезновения градиента концентрации при заданном объеме жидкой среды и вносимого в среду инокулята.