ВОДОРАСТВОРИМОЕ СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ ПРОТИВОВИРУСНОЙ И ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ, НА ОСНОВЕ СОЕДИНЕНИЯ ИОННОГО СЕРЕБРА С МЕТИЛЕНОВЫМ СИНИМ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2010 года по МПК A61K33/38 A61K31/5415 A61K31/28 A61P37/02 A61P31/12 

Изобретение относится к водорастворимым противовирусным и иммуномодулирующим лекарственным средствам, к области фармацевтической химии и медицины. Изобретение относится также к области получения этих средств. Изобретение может быть использовано для создания готовых лекарственных форм для лечения вирусных, бактериальных и других инфекций.

Цель - создание высокоэффективных противовирусных, иммуномодулирующих лекарственных препаратов, в особенности для лечения вирусных гепатитов и антибиотикоустойчивых инфекций, включая ВИЧ-инфекцию.

Сущность изобретения. Предложено новое противовирусное средство на основе соединения серебра с метиленовым синим и отвечающее составу C₁₆H₁₈Cl₂N₃SAg (табл.1).

Известны препараты под названием Аргохром фирмы Мерк (производившийся в Германии примерно с 1916 по 1945 годы и поступавший по импорту в СССР в довоенный период), состав которого подпадает под действовавший с 1914 года Патент Австрии №69476 и называвшийся до 1920 г. по-немецки Silber methylen blau, а также препарат Гегонон, выпускавшийся по патенту Германии №268968, изданному 7 января 1914, класс 12р, группа 16 - прототип. (См. справочник Вотчал Б.Е. и др. Фармацевтические препараты. М.-Л.: ОНТИ, 1934 г.).

Указанные препараты содержат серебро в ионной форме, прочно связанное с органическими молекулами - лигандами. Аргохром отличают повышенная токсичность и пожароопасность готового препарата из-за наличия нитрат ионов в структуре. Недостатком Гегонона является малая биодоступность содержащегося в них серебра, так как лигандом в этом препарате является высокомолекулярный носитель - альбумоза.

В последние годы в научной литературе появились сведения о том, что серебро является мощным иммуномодулятором. Под влиянием серебра повышается количество иммуноглобулинов классов А, М, G, индуцируется образование интерферона, увеличивается процентное содержание абсолютного количества

Т-лимфоцитов, то есть активизируется иммунитет. Кроме этого сами ионы серебра активно воздействуют на болезнетворные бактерии и вирусы.

В конце 90-х годов прошлого столетия убедительно было доказано, что метиленовая синь разрушает вирусы, в том числе вирусы гепатита, герпеса, СПИДа и т.д. Уже сейчас на станциях переливания крови в производстве препаратов из плазмы человека плазму обрабатывают раствором метиленовой сини и воздействуют светом для инактивации различных вирусов с последующим удалением метиленовой сини.

Метиленовая синь - это фенотиазиновый краситель. Красители этого класса способны внедряться в структуру нуклеиновых кислот вирусов и тесно связываться с остатками гуанидина ДНК/РНК.

Задачей изобретения явилось создание принципиально новой формы лекарственного соединения, которая позволяет достоинства каждого из компонентов соединить воедино и получить препарат, который обладает выраженными вирусингибирующими и иммуномодулирующими свойствами за счет эффективного проникновения препарата через биологические мембраны, начиная от проникновения в кровяное русло в случае перорального или ректального способов введения препарата, и нейтрализовать вирус вне клетки, а также эффективного проникновения комплекса через клеточную мембрану пораженной клетки с целью прекращения жизнедеятельности инфекционных агентов с одновременном запуском защитных сил организма.

Задача решается тем, что получен водорастворимый фотостойкий в растворах препарат серебра, представляющий собой прочный металлокомплекс серебра с метиленовым синим.

Предложен также способ получения нового водорастворимого противовирусного лекарственного средства (субстанции), заключающийся в том, что синтез осуществляют при нагревании до 90-95°С смешением следующих компонентов: метиленовый синий - хлорид серебра - аммиак в мольном соотношении 1,06:1:58, при этом в воде вначале растворяют метиленовый синий, к полученному раствору добавляют заранее приготовленный раствор аммиачного комплекса хлорида серебра, полученный смешением рассчитанных количеств суспензии хлорида серебра и 25% водного раствора аммиака, реакционную смесь нагревают до 90-95°С и выдерживают 1 ч, реакционную смесь охлаждают, отфильтровывают побочный продукт, упаривают в вакууме, к твердому остатку добавляют ацетон и растирают до гомогенного состояния, осадок фильтруют, промывают ацетоном и сушат до постоянного веса в вакууме при комнатной температуре.

Предлагаемое средство отвечает химическому составу C₁₆H₁₈Cl₂N₃SAg.

Пример осуществления способа.

Метиленовый синий (25 г, 66.9 ммоль) растворяют при нагревании до 60-70°С в 500 мл дистиллированной воды. Раствор охлаждают до комнатной температуры и к раствору при интенсивном перемешивании добавляют заранее приготовленный раствор хлорида серебра (9 г, 62.8 ммоль) в концентрированном (25%) растворе аммиака (250 мл). Реакционную смесь при перемешивании нагревают до 90-95°С и выдерживаю при перемешивании и такой температуре 1 ч. Реакционную смесь охлаждают, отфильтровывают выпавший осадок и полученный раствор упаривают на ротационном испарителе. К твердому остатку добавляют 0.5 л ацетона, осадок со стен снимают шпателем и оставляют на магнитной мешалке на 3 ч. Осадок отфильтровывают, промывают несколькими порциями ацетона (суммарный объем ацетона 1,2 л). Осадок сушат на фильтре, затем в вакуум-эксикаторе до постоянного веса. Выход 24.3 г (78.4%).

Данные элементного анализа заявляемого средства, представленные в таблице 1, получены с использованием автоматического анализатора элементного состава. Содержание серебра определялось атомно-адсорбционным методом.

Таблица 1 Данные элементного анализа Найдено (%) С Н N Cl Ag 41.12 4.11 9.14 15.22 23.34 41.46 4.04 9.64 15.23 23.20 41.40 3.83 9.24 15.10 22.91 Вычислено (%) для C₁₆H₁₈Cl₂N₃SAg 41.49 3.92 9.07 15.31 23.29

Результаты лабораторных исследований на биологическую активность заявленного средства с условным названием Арготиазин.

В результате проведенных экспериментов в лабораторных условиях была изучена цитотоксичность и противовирусная и интерфероногенная активность заявляемого средства с условным названием Арготиазин.

Методика исследования и результаты.

Определение токсичности препарата in vitro

Определение токсичности препаратов in vitro проводили в соответствии с «Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (под общей ред. Р.У.Хабриева, 2005).

В работе использовалась перевиваемая клеточная линия СПЭВ (перевиваемая клеточная линия эмбрионов почки свиньи), ФЭК (фибробласты куриного эмбриона) и перевиваемая линия культуры клеток L-929.

Все опыты проводили в трехкратной повторности. Статистическую обработку - общепринятыми методами (И.П.Ашмарин и соавт., 1974).

Для определения токсичности in vitro готовили различные разведения препарата в культуральной среде, которые вносили в двух-трехсуточной монослой культуры клеток, выращенной микрометодом в 96-луночных планшетах.

На одно разведение препарата использовали 4 лунки с монослоем культуры клеток. Цитотоксическое действие препарата а клетки учитывали по степени изменения монослоя и контролировали в течение 3 суток.

Цитодеструктивное действие препарата отмечали по 4-крестовой системе, по методу Финтера, где 100% деструкция клеток обозначается четыре креста + + + +, на 75% обозначается тремя крестами + + +, на 50% обозначается двумя крестами + + и на 25% обозначается одним крестом +. Минимальная концентрация препарата, вызывающая цитотоксический эффект на 50%, это два креста + +, рассматривается как цитопатогенная доза (ТЦД₅₀).

Исследования показали, что Арготиазин был нетоксичен в культуре клеток СПЭВ в дозе до 18±2,0 мкг/мл, а в культуре клеток ФЭК до 19±3,0 мкг/мл.

Исследования вирусингибирующей активности препарата Арготиазин на клеточных культурах СПЭВ и ФЭК

Вирусингибирующую активность препаратов определяли с помощью микрометода (Руководство под ред. Хабриева Р.У. - Москва. - 2005. - С.536). В качестве тест-вируса использовали вирус везикулярного стоматита (ВВС), вакцинный штамм Индиана в дозе 100 ЦПД₅₀ ВВС. Ингибирование вируса препаратами оценивали через 48 часов путем определения титра вируса в надосадочной жидкости.

Таблица 2 Вирусингибирующая активность препарата Арготиазин в отношении вируса ВВС в клеточной культуре СПЭВ Название препарата Использован ная доза препарата Количество вируса ВВС (M±m), lg
ТЦД_{50/0,1 мл} Опыт Контроль Арготиазин 16 мкг/мл Не определяется 4,46±0,16 8 мкг/мл 2,32±0,16 4 мкг/мл 3,82±0,12

Исследования показали, что в клеточной культуре СПЭВ препарат Арготиазин полностью блокирует размножение вируса в дозе - 16 мкг/мл, т.е. вирус не определялся в надосадочной жидкости, в то время как в контроле, где не было препарата, накопление вируса достигает до 4,461g±0,16ТЦД_{50/0,1 мл}.

Таблица 3 Вирусингибирующая активность препарата Арготиазин в отношении вируса ВВС в клеточной культуре ФЭК Название препарата Использованная доза препарата Количество вируса ВВС (М±m), lg
ТЦД_{50/0,1 мл} Опыт Контроль Арготиазин 16 мкг/мл Не определяется 4,88±0,16 8 мкг/мл 3,46±0,022 4 мкг/мл 3,98±0,28

Исследования показали, что в клеточной культуре ФЭК препарат Арготиазин полностью блокирует размножение вируса в дозе - 16 мкг/мл, т.е. вирус не определяется в надосадочной жидкости, в то время как в контроле, где не было препарата, накопление вируса достигает до 4,88lg±0,16ТЦД_{50/0,1 мл}.

Определение интерферониндуцирующей активности препарата in vitro.

Для определения интерферониндуцирующей активности препарата Арготиазин in vitro его вносили в нетоксичных дозах: 10; 100 мкг/мл в 48-часовую культуру клеток

L-929 (токсическая доза для клеток L-929 была выше 125 мкг/мл). Контакт культуры клеток с препаратом составлял соответственно 6 (для определения раннего интерферона) и 24 часа (позднего интерферона), после чего его удаляли, клетки тщательно отмывали и заливали свежей питательной средой. Через 24 ч инкубации культуральную жидкость (супернатант) собирали и использовали для определения активности интерферона. Определение интерферона в образцах супернатантов и в сыворотке крови мышей определяли титрованием в культуре клеток L-929. С этой целью клетки в концентрации 3×10⁵ выращивали в 96-луночных плоскодонных планшетах при 37°С в термостате с 5% CO₂ в среде Игла MEM с двойным набором аминокислот, 5% фетальной сыворотки крови и 100 мкг гентамицина в течение 24-48 часов до образования плотного монослоя.

Определение интерферониндуцирующей активности препарата in vivo.

Для определения интерферониндуцирующей активности препарата in vivo использовали нелинейных белых мышей массой 16-18 г, подобранных в группы по принципу аналогов по 3 на каждую дозу препарата (10; 100 мкг/кг массы тела), вводимую внутрибрюшинно. Препарат вводили животным в одинаковом объеме, контрольным - в таком же объеме физиологический раствор.

Все опыты проводили в трехкратной повторности, полученные результаты статистически обрабатывали общепринятыми методами.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Результаты исследований по определению интерферониндуцирующей активности препарата Арготиазин in vitro в культуре клеток представлены на фиг.1.

Контакт препарата с клетками в течение 6 и 24 часов приводил к незначительной индукции образования интерферона 5,33±1,09 - 9,33±2,88 МЕ/мл и 9,33±2,88 - 10,67±2,18 МЕ/мл соответственно.

Результаты исследований по определению интерферониндуцирующей активности различных доз препарата Арготиазин in vivo на нелинейных белых мышах после внутрибрюшинного введения представлены на фиг.2.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что внутрибрюшинное введение различных доз препарата Арготиазин приводило к выработке как раннего, так и позднего интерферона у нелинейных белых мышей. Через 6 часов после однократного введения препарата показатели сывороточного интерферона у них составили: 9,33±2,88 - 10,67±2,17 МЕ/мл, а через 24 - 13,33±2,3 - 18,67±4,46 МЕ/мл. В течение трех суток отмечали снижение сывороточного интерферона, индуцированного препаратом Арготиазин, до 9,33±2,88 и 13,33±2,3 МЕ/мл соответственно вводимой дозе (10; 100 мкг/кг массы тела животного).

В результате проведенных исследований установлено, что препарат Арготиазин после однократного введения вызывает выработку интерферона в культуре клеток (in vitro), а также в организме беспородных белых мышей (in vivo).

Полученные результаты исследования свидетельствуют об интерферониндуцирующей активности in vitro и in vivo у препарата Арготиазин.

В результате проведенной работы найдена нетоксичная доза препарата для перевиваемой клеточной линия СПЭВ (перевиваемая клеточная линия эмбрионов почки свиньи), ФЭК (фибробласты куриного эмбриона) in vitro. Данная доза проявила выраженные вирусингибирующие свойства и полностью блокировала размножение вируса в клеточной культуре.

Исследования показали, что препарат обладает также и иммуномодулирующими свойствами, индуцирует образование интерферона in vitro и in vivo. Таким образом, в заявляемом препарате соединяются как противовирусные, так и иммуномодулирующие свойства. Применение данного препарата в качестве основы противовирусных и иммуномодулирующих лекарственных средств позволит получить новые эффективные лекарственные средства с иным механизмом действия по сравнению с ныне применяемыми лекарственными препаратами.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг.1 представлены данные по активности интерферона в образцах супернатантов культуры клеток, индуцированного различными дозами препарата (1 - до введения препарата; 2 - через 6 часов и 3 - через 24 после введения препарата).

На фиг.2 представлены данные по активности интерферона в образцах сыворотки крови нелинейных белых мышей, индуцированного разными дозами препарата (4 - 10 мкг/кг массы тела; 5 - 100 мкг/кг массы тела; 6 - контроль).

Изобретение относится к водорастворимому лекарственному средству на основе ионного серебра с метиленовым синим, а также к способу его получения. Способ получения заключается в том, что синтез осуществляют при нагревании до 90-95°С смешением следующих компонентов: метиленовый синий-хлорид серебра-аммиак в мольном соотношении 1,06:1:58, которые затем охлаждают, отфильтровывают побочный продукт, упаривают в вакууме, промывают ацетоном и сушат в вакууме при комнатной температуре. Получаемое лекарственное средство отвечает составу C₁₆H₁₈Cl₂N₃SAg и обладает противовирусным и иммуномодулирующим действием. 2 н.п. ф-лы, 2 ил., 3 табл.

1. Способ получения водорастворимого средства, обладающего противовирусной и иммуномодулирующей активностью, заключающийся в том, что синтез осуществляют при нагревании до 90-95°С смешением следующих компонентов: метиленовый синий-хлорид серебра-аммиак в мольном соотношении 1,06:1:58, при этом в воде вначале растворяют метиленовый синий, к полученному раствору добавляют заранее приготовленный раствор аммиачного комплекса хлорида серебра, полученный смешением рассчитанных количеств суспензии хлорида серебра и 25%-ного водного раствора аммиака, реакционную смесь нагревают до 90-95°С и выдерживают 1 ч, реакционную смесь охлаждают, отфильтровывают побочный продукт, упаривают в вакууме, к твердому остатку добавляют ацетон и растирают до гомогенного состояния, осадок фильтруют, промывают ацетоном и сушат до постоянного веса в вакууме при комнатной температуре.

2. Водорастворимое средство, обладающее противовирусной и иммуномодулирующей активностью, на основе соединения ионного серебра с метиленовым синим, полученное способом по п.1 и отвечающее составу C₁₆H₁₈Cl₂N₃SAg.