Способ определения пролиферативной активности лимфоцитов при ревматоидном артрите Советский патент 1988 года по МПК G01N33/536 

(21)3935906/28-14

(22)24.07,85

(46) 07.09.88. Бюл. № 33

(71)Институт клинической иммунологии СО АМН СССР

(72)В.С, Ширинский, Н.М. Старостина и М.А. Тихонова

(53)615.373.(088.8) .

(56)Agents and Actions, 1981, II, № , p. 606-608.

(54)СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОЛИФЕРАТИБ- НОЙ АКТИВНОСТИ ЛИМФОЦИТОВ ПРИ РЕВМАТОИДНОМ АРТРИТЕ

(57)Изобретение относится к медицине, предназначено для определения пролиферативной активности лимфоцитов у больных равматоидным артритом (РА). Цель изобретения - влияние иммунных

комплексов (ИК) на пролиферативную активность лимфоцитов. Для этого вьще- ляют мононуклеары здоровых людей и больных РА. Добавляют к ним синовиальную жидкость больных с содержанием ИК и без них. Суспензию моноцитов периферической крови, обработанную и не обработанную ИК, вносят в культуру аутологичных мононуклеарных клеток, инкубируют клетки в присутствии активаторов пролиферации Т- и Б-ЛИМФОЦИТОВ и добавляют их в культуру нелимфоидных клеток, Учет пролиферативной активности лимфоцитов проводят радиоизотопным методом. Пролиферативную активность лимфоцитов определяют по индексу суп- прессии нелимфоидных клеток.

(О

Изобретение относится к медицине и:может быть использовано для определения пролиферативной активности лимфоцитов у больных -РА.

изобретения является по- ВЕйшенйе информативности способа за счет определения влияния иммунных комплексов (ИК) на пролиферативную активность лимфоцитов,

.Пример 1 . Синовиальную жидкость получают пункцией коленного состава, от больного равматоидным артритом (РА), Жидкость дентрифу -ируют при ,10000 об/мин 40 мин. ИК осаждали 2,5%-ным раствором полиэтиленглико- ля и центрифугированием при 10000 об /мин 45 мин. После центрифугирования в над осадке ИК не -определялись во всех случаях. Освобождение над- осадка от полиэтиленгликоля проводили элюцией на колонке мм с се фадексом С-75 (Pharmacia), уравнове- шенньм забуференным фосфатным физиологическим раствором рН 7,4 со ско- ростью 25 мм/ч, результаты регистрировали на аппарате Увикорд-2. Элю- ат концентрировали при помощи системы на фильтрах ХМ-50 в 15-20 раз. Концентрацию белка в .элю- ате определяли по методу Лоури и доводили до исходной.

Обогащенную суспензию моноцитов периферической крови здоровых и больных РА получали после инкубации мононуклеаров (МНК) при в течение часа в пластиковых чапжах Петри. Неприлипшие клетки удаляли, а к прилипшим моноцитам добавляли среду Б:Ш1- 640 с содержанием 20% синови- альной жидкости, не содержащей ИК к содержащие их до и после элиминации. Образец синовиальной жидкости предварительно прогревали при 56 С 30 мин. После инкубации в течение получаса прилипшие клетки (Л-клетки) снимали раствором лидокаина 30 ммоль /моль (ll) н дозирование добавляли к: аутологичным неприлипшим клеткам. Первая доза в соотношении 1:9, затем 3:7. Первое соотношение соответствует нормальному содержанию моноцитов в мононуклеарах, выделенных з азан- faiM образом, а второе - повышенному содержанию моноцитов и гиперпродукции ими ПГЕ

Затем в культуре МНК генерировали комплекс регуляторных клеток, например, Тс. Для генерации Тс три рав

п

5 0 5 о

,, с

5

5

Hbje взвеси МНК с содержанием I lO жизнеспособных клеток в 1 мл среды инкубировали соответственно с туберкулином (8 мкг/мл), гистамином (50 мкг/мл) в течение 24 ч, ФГА-Р (10 мкг/мл) в течение 72 ч- с добавлением 20% смешанной сыворотки крови АВ (IV) группы человека. Первичные культуры обрабатывали митомици- ном С в дозе 40 мкг/мл 30 мин, переносили во вторичную культуру алло- генных лимфоцитов в равных соотношениях, инкубировали с ФГА-Р 72 ч. Учет пролиферативной активности лимфоцитов проводили радиоизотопным методом. Индекс супрессии вычисляли по формуле

число импульсов/мин в опыте -,лло

1 - -, - 1 ии/ь (

ЧИСЛО импульсов/мин в контроле

Угнетение синтеза ПГЕ-проводили ,. добавлением к А-клеткам ингибитора простагландинсинтетазы - индомета- цина в, дозе 1 мкг/мл на все время инкубации их с образцом синовиальной жидкости.. Экзогенный ПГЕх|Добав- ляли в первичные культуры мононукле- Л ft

аров в дозах 10 -10 М. Фиброблас- ты эмбриона человека выращивали в пенициллиновых флаконах. Пролиферативную активность фибробластов и оценку игздекса супрессии проводят указанным образом.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить информативность определения пролиферативной активно- сти лимфоцитов за счет определения влияния ИК на нее

Формула изобретения

Способ определения пролиферативной активности лимфоцитов при ревматоидном артрите, включающий выделение мононуклеаров здоровых людей и больных ревматоидным артритом, добавление к ним синовиальной жидкости больных, содержащей и не содержащей иммунные комплексы, и определение пролифератиБной активности лим- фоидных клеток, отличаю щи й- ся тем, что, с целью повьш1ения информативности за.счет определения влияния иммунных комплексов на пролиферативную активность лимфоцитов, дополнительно суспензи о моноцитов, обработанных и не обработанных иммунными комплексами,вносят в культуру аутоло- гичных мононуклеариых клеток, далее инкубируют клетки в присутствии актива3U22156

торов пролиферации Т- и В-лимфоцитов пролиферативной активности лимфоцитов и добавляют их в культуру нелимфоид- по индексу супрессии нелимфоидных ных клеток с последующим определением клеток.