ШТАММ БАКТЕРИЙ NEISSERIA MENINGITIDIS СЕРОГРУППЫ С, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МЕНИНГОКОККОВОГО АДГЕЗИНА Российский патент 1997 года по МПК C12N1/20 A61K39/95 C12N1/20 C12R1/36 

Изобретение относится к медицинской биотехнологии и касается получения менингококкового адгезина препарата бактериального происхождения, используемого, например, для определения степени адгезии менингококков при их взаимодействии с клетками макроорганизма.

Известен штамм Neisseria meningitidis В-202, используемый для получения менингококкового адгезина (а.с. СССР N 1412310, 1988). Этот штамм относится к серогруппе В, в связи с чем получаемый из него адгезин позволяет определять адгезивные свойства клеток макроорганизма только в отношении возбудителя менингококковой инфекции серогруппы В. Этот недостаток известен, в частности, из работ. (Корольков В.Ф. и др. Проблемы гетерогенности и специфичности в оценке конституционной восприимчивости к менингококковой инфекции. В сб. "Менингококковая инфекция и гнойные менингиты", М. 1990, т. 1, с. 109-110; Поспелов В.Ф. и др. Проявление гетерогенности в адгезивном взаимодействии менингококков с клетками человека. -"Профилактическая медицина. Состояние и перспективы". Л. 1991, с. 108).

Из этих работ вытекает необходимость изыскания штамма возбудителя менингококковой инфекции продуцента менингококкового адгезина серогруппы С, что и является задачей предлагаемого технического решения.

Известные штаммы Neisseria meningitidis серогруппы С: 54, 0638, 23248, 896, 655, 691, С11, 2000Гм, CPB и C2241 прототип (Каталог Всесоюзного музея патогенных бактерий, М. 1982) либо не обладают адгезивной активностью, либо утрачивают ее при пересевах, вследствие чего не могут быть использованы для получения менингококкового адгезина.

Целью изобретения является штамм менингококков серогруппы С, обладающий высокой и стабильной адгезивной активностью.

Указанная цель достигается использованием штамма Neisseria meningitidis 141 (коллекция ГИСК им. Л.А. Тарасевича N 194).

Штамм выделен из носоглотки бактерионосителя с последующим клонированием и отбором наиболее активного варианта. Он характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки. Полиморфные грам-отрицательные диплококки размером 1-1,5 мкм. При электронной микроскопии у части микробных клеток обнаруживаются фимбрии. На плотной питательной среде (2 агар на основе перевара Хоттингера с добавлением 20 инактивированной лошадиной сыворотки и 0,5 глюкозы или мальтозы) дает выход биомассы до 10 млрд/мл. Длительность культивирования 20 ч. Колонии мелкие, прозрачные, диаметром 1-2 мм.

Физиолого-биохимические признаки. Оптимальная температура культивирования 37^oC. Оптимальная pH 7,3±0,1. Биохимическая активность выражена слабо. Ферментирует с образованием кислоты глюкозу и мальтозу, не ферментирует сахарозу, левулезу и лактозу.

Антигенные свойства. Относится к серогруппе С.

Адгезивные свойства. Прилипает к эпителиоцитам слизистой оболочки щек и эритроцитам человека, агглютинируя последние. Индекс адгезии (ИА) к эпителиацитам составляет 20-40. Минимальная гемагглютинирующая концентрация (МГАК) зависит от индивидуальной принадлежности эритроцитов и находится в диапазоне от 0,12 до 4,0 млрд/мл.

Пример. Лиофилизированную культуру N. meningitidis 141 высевают на чашки Петри, заполненные 2-ным агаром Хоттингера с добавлением 20 инактивированной лошадиной сыворотки и 0,5 глюкозы и инкубируют в течение 20 ч при 37^oC. Выращенную культуру контролируют на чистоту под микроскопом при косом освещении. Чистую культуру смывают 10-ным водным раствором сахарозы, дополнительно содержащим 1,5 мас. желатины. С одной чашки получают 5 мл 10-миллиардной взвеси менингококков, которую разливают по 1 мл в ампулы, замораживают в этаноле до -70^oC и лиофилизируют. Ампулы с высушенной культурой менингококков запаивают под вакуумом и подвергают гамма-облучению в дозе 1,25 Мрад. Полученный целевой продукт (менингококковый адгезин) контролируют на отсутствие жизнеспособных менингококков (путем высева на вышеуказанную питательную среду) и определяют его адгезивную активность в гемагглютинирующих единицах (ГАЕ). За 1 ГАЕ принимают максимальное разведение препарата, вызывающее агглютинацию стандартного образца эритроцитов человека. В данном примере адгезивная активность составляет 40 ГАЕ. Полученный препарат используют для определения индивидуальной чувствительности эритроцитов человека к адгезии менингококков серогруппы С. Для этого у 106 обследуемых берут по 25 мкл крови из пальца и, суспендируя ее в 350 мкл раствора Олсвера, получают рабочие взвеси эритроцитов. Менингококковый адгезин разводят с шагом 2 в забуференном 0,9 -ном растворе NaCl (pH 7,3) и вносят по 180 мкл в лунки планшета. В каждую лунку с приготовленными разведениями препарата добавляют по 7 мкл вышеуказанной рабочей взвеси эритроцитов обследуемых и перемешивают. Реакционные смеси инкубируют 1 ч при 37^oC, а затем 18 ч при 4^oC, после чего определяют индивидуальную чувствительность эритроцитов по минимальной активности препарата, обусловившей агглютинацию. Результаты анализов приведены в табл. 1.

Предлагаемый штамм по сравнению с его аналогами обладает большей адгезивной активностью и стабильность в отношении сохранения этой активности при пересевах (табл. 2).

Из табл. 2 видно, что минимальная гемагглютинирующая концентрация (МГАК) предлагаемого штамма составляет 0,12-0,25 млрд/мл и сохраняется не менее, чем в 7 пассажах. Активность прототипного штамма в 2-8 раз ниже (МГАК от 0,5 до 1,0) и сохраняется лишь в 2-х пассажах. Остальные 9 испытанных штаммов имеют крайне низкую активность (МГАК > 4) и пассирование их бессмысленно.

Использование: медицинская биотехнология. Сущность изобретения: предложен новый штамм менингококков серогруппы С, обладающий высокой и стабильной адгезивной активностью. Штамм Neisseria meningitidis 141 депонирован в коллекции ГИСК им. Л.А.Тарасевича под номером 194. Штамм обладает высокой адгезивной активностью, сохраняя ее при пересевах. Полученный из него адгезин позволяет определить индивидуальную чувствительность эритроцитов человека к адгезии менингококков группы С. 2 табл.

Штамм бактерий Neisseria meningitidis серогруппы С ГИСК N 194, используемый для получения менингококкового адгезина.