ЛИПОПОЛИСАХАРИД ИЗ NEISSERIA MENINGITIDIS, ОБЛАДАЮЩИЙ ПРОТЕКТИВНЫМИ И ИММУНОГЕННЫМИ СВОЙСТВАМИ Российский патент 1997 года по МПК A61K35/74 

Изобретение относится к медицине, в частности к липополисахариду Neisseria meningitidis серогруппы В с молекулярной массой 30±10 кД, как кандидату будущей вакцины.

Известен менингококковый липополисахарид (ЛПС) Neisseria meningitidis серогруппы В штамма М981 (Chao-Ming Tsai и соавт. 1983), который находится в наружной клеточной мембране менингококка и имеет гликолипидную природу.

Авторы этого исследования получали менингококковый ЛПС серогруппы В по методу Westphal Jann (1965) с предварительной обработкой клеток Neisseria meningitidis, выращенных в колбах Fernbach в триптиказо-соевом бульоне при разном содержании кислорода в культуральной среде, которое определялось числом оборотов шейкера 140 и 90 об/мин, лизоцимом (Johnson K.G. Perry М.В.). Полученный препарат ЛПС имел минимальное количество примесей: белка, нуклеиновых и сиаловых кислот при высоком содержании кетодезоксиоктановой кислоты (КДО) 9% по сухому весу препарата. С.-М. Tsai и соавт. определяли КДО по методу Osborn M.J.(1971) с использованием тиобарбитуровой кислоты.

Авторы анализировали также полученные препараты ЛПС с помощью SDS/PAGE - электрофореза по системе Laemmli U.K. (1970) (5) с использованием 4М мочевины в 15% -ном полиакриламидном разделяющем геле. Результаты SDS/PAGE показали, что препарат ЛПС имел один низкомолекулярный компонент при лимите кислорода и два низкомолекулярных компонента при избытке кислорода в культуральной среде. Мажорный компонент характеризовался молекулярной массой 4800±300 Д, а минорный 4300 Д. В качестве маркера использовали ЛПС Salmonella typhimurium.

C. -M. Tsai и соавт. определили моносахаридный состав полученных препаратов ЛПС. Для обнаружения нейтральных сахаров образцы ЛПС были гидролизованы в 0,16 N метасульфоновой кислоте с добавлением Dowex 50. Моносахара в гидролизатах определяли с помощью анализатора, как описано у Boykins R.A. T. Y. Liu (1980) (6). Для определения аминосахаров и этаноламина образцы гидролизовали в 2N метансульфоновой кислоте. Гексозаминыи этаноламин были количественно определены на аминокислотном анализаторе Beckman model 121-M. Молевое соотношение моносахаров в молекуле ЛПС составило: Gal (0,7):GLC (3,8): Hep (2,0): GlcNH₂ (2,1): EtNH₂ (0,7).

Цель изобретения получить менингококковый серогруппы В липополисахарид, имеющий отличную от прототипа молекулярную массу.

Поставленная цель достигается тем, что при осуществлении управляемых непрерывных процессов культивирования Neisseria meningitidis серо группы В, из клеток менингококка мы получили препарат ЛПС, который отличается от вышеописанного, во-первых, электрофоретической картиной, во-вторых, молекулярной массой, в-третьих, соотношением моносахаров.

Пример. Источник выделения липополисахаридов (ЛПС) с разной молекулярной массой Neisseria meningitidis серогруппы В штамм N 125. Данный штамм селекционирован в НИИВиС им. И.И.Мечникова РАМН и депонирован в коллекцию патогенных бактерий Государственного научно-исследовательского института стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича МЗ России от 6.VIII.84 г.

Культивирование культуры проводили в синтетической питательной среде в ферментере. Процесс выращивания был непрерывным при постоянно контролируемом уровне кислорода, рН среды и оптической плотности биомассы.

Препараты ЛПС получали из клеток менингококка по методу Westphal Jann (1965).

Все полученные нами препараты ЛПС были охарактеризованы по химическому составу: содержание белка, нуклеиновых и сиаловых кислот. Белок определяли по методу Lowry O.H. сиаловые кислоты по методу Svennerholm в реакции с резорциновым реактивом, нуклеиновые кислоты по методу Спирина А.С. 2-кето-3-деоксиоктановую кислоту (КДО) определяли по методу Anaker R.L. с использованием тиобарбитуровой кислоты.

На чертеже ( 1,а) представлена биохимическая характеристика в полном объеме препарата ЛПС. Как видно из полученных данных, ЛПС был загрязнен сопутствующими примесями в пределах от 0,85 до 2,3% что в свою очередь соответствует стандарту чистоты препарата ЛПС.

Молекулярные параметры очищенных препаратов ЛПС изучали с помощью гель-фильтрации на колонке с носителем сефакрил S-300 и S-400 ("Pharmacia", Швеция), используя элюирующий буфер следующего состава: 20 mM трис, 2mM ЭДТА, 1% ДОХ-Na, рН 8,5. Колонки калибровали раствором, содержащим 0,2% голубой декстран М.В. 2000000Д ("Pharmacia", Швеция) и 0,5% мертиолят м.в. 405Д ("Serva", США). В каждой полученной фракции определяли КДО при длине волны 550 нм и на основании полученных данных строили профили элюции соответственно при 550, 254 и 280 нм соответственно. На чертеже (1,б) представлены результаты гель-фильтрации препарата ЛПС. На основании этих данных можно заключить, что препарат ЛПС имеет два пика элюции с .

На чертеже (1,в) отражены результаты электрофореза в ПААГ в системе Laemmli U.K. (1970) при 3%-=ном концентрирующем геле и 12%-ном разделяющем геле с последующим окрашиванием нитратом серебра по методу, описанному в работе Tsai C.-M. (1982) (1). Как видно из этого чертеже,препарат ЛПС имеет не только общеизвестный низкомолекулярный компонент, но и 28 30 высокомолекулярных полос, расположенных над ним в определенной последовательности, имеющих углеводную природу с молекулярной массой (30±10) кД.

Для получения более убедительного подтверджения того факта, что найденные нами более высокомолекулярные полосы принадлежат молекуле менингококкового серогруппы В липополисахарида, нами было определено соотношение моносахаров. Для этого сначала проводили деградацию препаратов ЛПС с помощью 1% -ного раствора уксусной кислоты при 100^oС в течение полутора часа. В результате мы имели липидную и углеводную части молекулы ЛПС. Эту часть наносили на колонку с перидинацетатным буфером, а в качестве сорбента использовали - ТСК-50 суперфайн. После проведения гель-фильтрации были получены 2 фракции: 1-я низкомолекулярная углеводная коровая часть молекулы ЛПС, 2-я - высокомолекулярная часть.

Моносахаридный состав этих фракций определяли методом ХМС в виде ацетатов полиолов и были идентифицированы глюкоза-Glc, галактоза- Gal, гептоза-Hep, глюкозамин -GlcNH₂ в соотношении которое было различно для препаратов ЛПС с разной молекулярной массой.

Полученные результаты по моносахаридному составу представлены в табл. 1.

Как видно из представленных в табл. 1 результатов, препараты ЛПС штамма N 125 с молекулярной массой 4-7 и 20-40 кД принципиально отличались по содержанию глюкозы и глюкозамина. Соотношение этих моносахаров было значительно выше, чем у ЛПС низкомолекулярного как штамма 125, так и штамма М986.

Для определения иммуносерологических свойств полученного препарата ЛПС использовали метод иммуноферментного анализа (ИФА), на основании которого рассчитывали константу связывания антигена с антителом (Ксв.) по методике, изложенной в работе Сорокиной Н.В. и соавт. (1989).///2 Полученные результаты представлены в табл. 2.

Согласно полученным данным, следует, что значения Ксв. антигена с антителом увеличиваются на два порядка с увеличением молекулярной массы менингококкового ЛПС.

Использование: медицина, для получения липополисахарида серогруппы В из N. meningitidis, обладающему протективным и иммуногенным действием. Сущность изобретения: липополисахарид получают из клеток, выращенных в условиях управляемого непрерывного процесса культивирования N.meningitidis серогруппы В штамма N 125 в синтетической питательной среде по методу Westphal & jann. 1 ил., 2 табл.

Липополисахарид из Neisseria meningitidis, обладающий протективными и иммуногенными свойствами, характеризующийся следующими признаками: выделен из штамма бактерий Neisseria meningitidis серогруппы В N 125, селекционированного в НИИВиС им. И.И.Мечникова и депонированного в коллекции патогенных бактерий ГНИИСиКМБП им. Л.А.Тарасевича МЗ России от 06.08.84 г; локализован в наружной клеточной мембране Neisseria meningitidis; выделен методом Westphal and Jann с использованием экстракции целевого продукта раствором фенола при (62±5^o)C; имеет следующее количество примесей, от сухой массы клеток:
Белок 2,30±0,20
Нуклеиновые кислоты 0,85±0,22
Сиаловые кислоты 1,03±0,37
Кетодезоксиоктановая кислота, по сухой массе препарата 9,36±0,60
мол.м. 30±10 кДальтон (при определении электрофорезом в полиакриламидном геле; имеет моносахаридный состав следующего содержания: галактоза, глюкоза, гептоза, глюкозамин в молярном соотношении 3,9 6,9 2,0 25,3; константа связывания антигена с антителом в тесте иммуноферментного анализа составляет К_св 0,39 • 10⁷ моль^-1.