ШТАММ БАКТЕРИЙ NEISSERIA MENINGIFIDIS СЕРОГРУППЫ А, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МЕНИНГОКОККОВОГО АДГЕЗИНА Российский патент 1997 года по МПК C12N1/20 A61K39/95 C12N1/20 C12R1/36 

Изобретение относится к медицинской биотехнологии и касается получения менингококкового адгезина препарата бактериального происхождения, используемого, например, для определения степени адгезии менингококков при их взаимодействии с клетками макроорганизма.

Известны штаммы, которые соответственно относятся к серогруппам В и С, в связи с чем получаемые из них адгезины позволяют определять адгезивные свойства клеток макроорганизма только в отношении возбудителей менингококковой инфекции данных серогрупп. Вместе с тем, из известных работ (Корольков В.Ф. и др. Проблемы гетерогенности и специфичности в оценке конституциональной восприимчивости к менингококковой инфекции. В. сб. Менингококковая инфекция и гнойные менингиты. М. 1990, т.1, с. 109-110; Поспелов В.Ф. и др. Проявление гетерогенности в адгезивном взаимодействии менингококков с клетками человека. -В кн. Профилактическая медицина. Состояние и перспективы. Л. 1991, с. 108) вытекает необходимость изыскания штамма возбудителя менингококковой инфекции продуцента менингококкового адгезина серогруппы А, что и является задачей предлагаемого технического решения.

Известные штаммы Neisseria meningitidis cерогруппы А, например SP 3428 (Тrust Т. J. еt al. //Infection and Immunity, 1983, 41,1, р. 106-113) и 356 (ГИСК), обладают крайне низкой адгезивной активностью (на эритроцитах).

Целью изобретения является штамм менингококков серогруппы А, обладающий высокой и стабильной адгезивной активностью.

Указанная цель достигается использованием штамма Neisseria meningitidis А 356/4 (коллекция ГИСК им. Л.А. Тарасевича N 224).

Штамм селекционирован из штамма Neisseria meningitidis 356 (ГИСК), выделенного из спинномозговой жидкости больного, с последующим клонированием и отбором наиболее активного варианта. Он характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признакию Полиморфные грамотрицательные диплококки размером 1-1,5 мкм. При электронной микроскопии у 40% микробных клеток обнаруживаются фимбрии. На плотной питательной среде (2%-ный агар на основе перевара Хоттингера с добавлением 20% инактивированной лошадиной сыворотки и 0,5% глюкозы или мальтозы) дает выход биомассы до 12 млрд./мл. Длительность культивирования 18-20 ч. Колонии мелкие, прозрачные, диаметром 1-2 мм.

Физиолого-биохимические признаки. Оптимальная температура культивирования 37^oC. Оптимальная рН -7,3 ± 0,1. Биохимическая активность выражена слабо. Ферментирует с образованием кислоты глюкозу и мальтозу, не ферментирует сахарозу, левулезу и лактозу.

Антигенные свойства. Относится к серогруппе А.

Адгезивные свойства. Прилипает к эпителиоцитам слизистой оболочки щек и эритроцитам человека, агглютинируя последние. Индекс адгезии (ИА) к эпителиоцитам составляет 56 ± 17. Минимальная гемагглютинирующая концентрация (МГАК) зависит от индивидуальной принадлежности эритроцитов и находится в диапазоне от 0,06 до 4,0 млрд./мл.

Пример. Лиофилизированную культуpу N. meningitidis A 356/4 высевают на чашки Петри, заполненные 10 мл 2%-ного агара Хоттингера с добавлением 20% инактивированной лошадиной сыворотки и 0,5% глюкозы, и инкубируют в течение 20 ч при 37^oC. Выращенную культуру контролируют на чистоту под микроскопом при косом освещении. Чистую культуру смывают 10%-ным водным раствором сахарозы, дополнительно содержащим 1,5 мас. желатины. С одной чашки получают 5 мл 10-миллиардной взвеси менингококков, которую разливают по 1 мл в ампулы, замораживают в этаноле до -70^oC и лиофилизируют.

Ампулы с высушенной культурой менингококков запаивают под вакуумом и подвергают гамма-облучению в дозе 1,25 Мрад. Полученный целевой продукт (менингококковый адгезин) контролируют на отсутствие жизнеспособных менингококков (путем высева на вышеуказанную питательную среду) и определяют его адгезивную активность в гемагглютинирующих единицах (ГАЕ). За 1 ГАЕ принимают максимальное разведение препарата, вызывающее агглютинацию стандартного образца эритроцитов человека. В данном примере адгезивная активность составляет 40 ГАЕ.

Полученный препарат используют для определения индивидуальной чувствительности эритроцитов человека к адгезии менингококков серогруппы А. Для этого у 137 обследуемых берут по 25 мкл крови из пальца и, суспендируя ее в 350 мкл раствора Олсвера, получают рабочие взвеси эритроцитов. Менингококковый адгезин разводят с шагом 2 в забуференном 0,9%-ном растворе NaCl (рН 7,3) и вносят по 180 мкл в лунки планшета. В каждую лунку с приготовленными разведениями препарата добавляют по 7 мкл вышеуказанной рабочей взвеси эритроцитов обследуемых и перемешивают. Реакционные смеси инкубируют 1 ч при 37^oC, а затем 18 ч при 4^oC, после чего определяют индивидуальную чувствительность эритроцитов по минимальной активности препарата, обусловившей агглютинацию.

Результаты анализов приведены в табл. 1.

Предлагаемый штамм по сравнению с прототипом обладает большей адгезивной активностью и стабильностью в отношении сохранения этой активности при пересевах (табл. 2).

Из табл. 2 видно, что минимальная гемагглютинирующая концентрация (МГАК) предлагаемого штамма составляет 0,12-0,25 млрд./мл и сохраняется не менее чем в 7 пассажах. Активность прототипного штамма в 2-8 раз ниже (МГАК от 0,5 до 1,0) и сохраняется лишь в 2 пассажах. Остальные 9 испытанных штаммов имеют крайне низкую активность (МГАК > 4), и пассирование их бессмысленно.

Использование: штамм бактерий Neisseria meningitidis, серогруппа А, менингококковый адгезин. Сущность изобретения: штамм Neisseria meningitidis 356/4 (коллекция ГИСК им. Л.А. Тарасевича N 224) селекционирован из штамма Neisseria meningitidis 356 (ГИСК), выделенного из спинномозговой жидкости больного, с последующим клонированием и отбором варианта с высокой и стабильной адгезивной активностью. Грамотрицателен. До 40% микробных клеток образуют фимбрии. На плотной питательной среде 2%-ного агара Хоттингера с добавлением 20% инактивированной лошадиной сыворотки и 0,5% глюкозы при длительности культивирования 18-20 часов дает выход биомассы до 12 млрд./мл. Ферментирует с образованием кислоты глюкозу и мальтозу, не ферментирует сахарозу, левулезу и лактозу. Относится к серогруппе А. Прилипает к эритроцитам человека и эпителиоцитам слизистой оболочки щек. Индекс адгезии составляет 56 ± 17. 2 табл.

1 Штамм бактерий Neisseria meningitidis серогруппы А 356/4 ГИСК-224, используемый для получения менингококкового адгезина.