ШТАММ ДРОЖЖЕЙ YARROWIA LIPOLYTICA - ПРОДУЦЕНТ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ И СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ЦИТРАТА НАТРИЯ Российский патент 1997 года по МПК C12N1/16 C12P7/48 C07C59/265 C12N1/16 C12R1/73 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению лимонной кислоты и цитрата натрия с помощью штамма дрожжей Yarrowia lipolytica - продуцента лимонной кислоты и выделению ее или ее натриевой соли.

Лимонная кислота является подкислителем и консервантом, широко используется в пищевой промышленности (производстве безалкогольных напитков, кондитерских изделий, пищеконцентратов, консервов), а также в парфюмерной, табачной, фармацевтической, медицинской, химической промышленности, в электронике и котлоочистке.

Соль лимонной кислоты цитрат натрия находит широкое применение в качестве компонента смесей для детского питания, культивирования культур клеток животных и человека, консерванта крови, стабилизатора стерилизованной молочной продукции, пластификатора в производстве пластмасс, лаков и красок, входит в состав лекарственных препаратов для лечения мочекаменных болезней, рахита, алкоголизма и др. Технический цитрат натрия используется при производстве экологически чистых синтетических и технических моющих средств, заменяя частично или полностью триполифосфат натрия, таким образом исключается попадание фосфора в водоемы и связанное с этим зарастание водоемов сине-зелеными водорослями и мор рыбы.

Современное производство лимонной кислоты основано на использовании в качестве продуцента различных мутантных штаммов гриба Aspergillus niger и мелассы в качестве сырья. Процесс производства является сложным, экологически небезопасным, в результате его осуществления образуется большое количество жидких стоков, содержащих минеральные кислоты, балластные органические вещества, цианиды, одновременно накапливается большое количество твердых отходов, в первую очередь гипса. Продуцент кислоты Aspergillus niger относится к условно патогенным грибам, может вызывать аллергические заболевания и аспергиллез.

В последние годы дрожжи рассматриваются в качестве перспективных продуцентов различных веществ, включая органические кислоты.

Наиболее перспективными продуцентами лимонной кислоты и цитрата являются дрожжи вида Yarrowia lipolytica(=Candida lipolytica=Saccharomycopsis lipolytica).

Известны штаммы Yarrowia lipolytica продуценты лимонной кислоты на средах, содержащих различные соединения глюкозу, н-алканы, (патент США 4278764, кл. C 12 P 7/42, 1981, патент Великобритании 1297234, кл. C 2 C, 1972. патент Великобритании 1182983, кл. C 07 C 59/16, 1972), ацетат, глицерин, этанол в качестве источников углерода.

В патенте ГДР N 232309 (кл. C 12 P 7/48, 1986,) сообщается о возможности получения лимонной кислоты с помощью дрожжей Saccharomycopsis lipolytica ZIMET 43720 на среде, содержащей этиловый спирт, однако никаких конкретных данных не приводится.

Финогенова Т.В. и соавторы (Финогенова Т.В. Гринчак А.В. Илларионова В. И. Шишканова Н.В. Биосинтез лимонной и изолимонной кислот природным и мутантным штаммами Candida lipolytica на средах с различными источниками углерода. Прикл. биохимия и микробиология, 1979, Т. 15. Вып. 6, 811) сообщили, что дикий штамм Candida lipolytica 704 и его мутант N 1 способны продуцировать лимонную кислоту на среде с этанолом при лимитировании их роста источником азота. Однако концентрация лимонной кислоты была низкой 4,7 г/л, а выход от внесенного субстрата не превышал 25-30%
Известен способ получения лимонной кислоты мутантом дрожжей Yarrowia lipolytica N 1 из этанола в условиях непрерывного культивирования (Камзолова С. В. и др. Влияние ионов железа на биосинтез лимонной и изолимонной кислот мутантным штаммом Yarrowia lipolytica N 1 в условиях непрерывного культивирования. Прикл. биохимия и микробиол. 1996, том 32, вып. 1 стр. 39-42)
Недостаток этого способа заключается в том, что концентрация кислоты (21,8 г/л) и ее выход от субстрата (55%) были низкими. Низкой была и объемная производительность ферментера 0,3 г кислоты/л.час, или 7,7 кг кислоты/м³ сутки.

Известен способ повышения продуктивности микроорганизмов-продуцентов путем использования вместо обычного ферментера мембранного биологического реактора (МБР), представляющего собой современный ферментер, соединенный с мембранным модулем и насосом. Такое устройство позволяет непрерывно удалять образующийся внеклеточный продукт, полностью или частично возвращать клетки продуцента в ферментер, поддерживая оптимальные условия для синтеза целевого продукта (Cheryan M. and Menaia M.A. Membrane bioreactors, in "Membrane separation in Biotechnology" MacGregor W.C. editor, Marcel Dekker, New York, 1987, 255-301). Данные публикации не касаются получения лимонной кислоты.

Известен способ получения лимонной кислоты с помощью дрожжей Saccharomycopsis lipolytica и Candida lipolytica с использованием МБР, имеющего в качестве фильтрационного элемента полые волокна (патент США 4278764, кл. C 12 P 7/42, 1981). В данных публикациях в качестве источника углерода для получения лимонной кислоты использовали сахара глюкозу и сахарозу, этиловый спирт не использовали.

Известен отъемно-доливной способ получения лимонной кислоты, заключающийся в том, что используют отъем среды, содержащей целевой продукт, с последующим доливом свежей среды (Карклиныш Р.Я. Лиепиныш Г.К. Микробный биосинтез лимонной кислоты. Рига. "Зинатне", 1993, с. 162-163).

Этот способ применялся только для получения лимонной кислоты с помощью грибов A. niger из мелассы.

Выделение солей лимонной кислоты цитрата щелочных металлов, обычно проводят из кристаллической лимонной кислоты путем нейтрализации соответствующей щелочью.

Традиционный метод выделения лимонной кислоты из нативных растворов микробиологического синтеза включает ее осаждение известковым молоком с последующим разложением цитрата кальция серной кислотой, отделение сульфата кальция из раствора фильтрацией и выделение лимонной кислоты из раствора с последующим обесцвечиванием, обессоливанием, выпаркой, кристаллизацией и сушкой (В.А. Смирнов. Пищевые кислоты, 1983 г. стр. 151-193).

Известны также способы выделения лимонной кислоты из нативного раствора экстракцией органическими растворителями, содержащими третичный амин. Из экстракта лимонную кислоту реэкстрагируют водой при более высокой температуре (Европейский патент N 460854, кл. C 07 C 59/265, 1991, патент Чехословакии N 277812, C 07 C 55/22, 1993).

Эти способы предъявляют слишком большие требования к органическим растворителям, которые должны быть высокоселективными, малорастворимыми в воде, иметь плотность, отличающуюся от плотности раствора лимонной кислоты, быть нетоксичными, недефицитными и недорогими.

В патенте США N 5041645, 1991, 562-584 предусматривается превращение лимонной кислоты в терхзамещенный цитрат натрия с последующим осаждением из раствора большим количеством этанола. Недостаток способа заключается в сравнительно низком выходе целевого продукта, кроме того, необходимо регенерировать большой объем органического растворителя, что делает процесс технологически трудным и энергоемким.

Известен также способ выделения лимонной кислоты, полученной при культивировании дрожжей Candida lipolytica на н-парафинах с помощью электродиализа. При этом выход на стадии электродиализа составляет не более 85% (патент США N 3968017, B 01 D 13/00). Такие подходы сложны, энергоемки.

В последнее время значительное внимание уделялось сорбционному способу выделения как лимонной кислоты, так и цитратов. Типичный сорбционный способ выделения описан в Европейском патенте N 324221, кл. C 07 D 257/04, 1989.

В этом патенте указано, что ферментационный раствор лимонной кислоты при pH раствора, равном 3,13, приводится в контакт с полимерным адсорбентом, который может быть как нейтральным не содержащим ионогенных групп гидрофобным полимером полиакрилового эфира, так и слабоосновной анионобменной смолой, имеющей функциональную группу третичного амина, или сильноосновной анионобменной смолой, имеющей функциональную группу четвертичного амина. Во время контакта лимонная кислота сорбируется на смоле. Далее сорбированную кислоту со смолы элюируют либо щелочью, либо солями щелочных металлов.

В указанном способе для получения цитратов на стадии выделения приходится лимонную кислоту переводить в форму цитрата. Кроме того, присутствующие в ферметационном растворе смеси сопутствующих ионов (из ферментационной среды) нарушают установление на анионитовом слое стационарного сорбционного фронта и значительно снижают емкость смолы по цитрат-иону. Все это негативно сказывается на выходе целевого продукта и его качестве.

Альтернативный процесс сорбции, для выделения лимонной кислоты из ферментационного раствора описан в Японском патенте N 58-16454 и в Европейском патенте N 592123, кл. C 07 C 59/265, 1994. В этих работах лимонную кислоту выделяют в виде соли щелочного металла путем адсорбции остаточной глюкозы на анионите в SO2-4

Основной недостаток указанных сорбционных методов выделения соли лимонной кислоты заключается в том, что перед получением целевого продукта исходный ферментационный раствор очищают от смеси сопутствующих ионов, которые в конечном счете, переходя в состав целевого продукта, ухудшают его качество и значительно снижают технологические показатели.

Приведенные выше способы очистки лимонной кислоты и ее соли трудно реализуемы в промышленных условиях.

Наиболее близким к предлагаемому штамму следует считать штамм дрожжей Yarrowia lipolytica НММ 217 (BKM Y-2785 Д) продуцент лимонной кислоты (патент Италии N 1256043, C 12 K, 1995).

Данный штамм хорошо растет и синтезирует лимонную кислоту на чистом этиловом спирте, в примерах приведены данные, полученные при использовании спирта-ректификата.

При использовании в качестве источника углерода технического этилового спирта или спиртов, содержащих эфиры и альдегиды, происходит торможение роста культуры и ингибирование синтеза кислоты.

Кроме того, данный штамм требует высокой концентрации кислорода в среде, для активного синтеза лимонной кислоты необходимо поддерживать концентрацию кислорода в среде 50-80% от насыщения.

Наиболее близким к предлагаемому способу получения лимонной кислоты является способ, который заключается в том, что культивируют штамм Yarrowia lipolytica HMM 217 (BKM Y-2785 Д) при аэробных условиях на питательной среде, содержащей источники азота, фосфора, микроэлементы и этанол в качестве единственного источника углерода (патент Италии N 1256043, C 12 K, 1995), подавая этанол непрерывно или дискретно.

Согласно этому способу культивирование продуцента проводят не более 5 суток, так как при продолжении культивирования биосинтетическая активность штамма резко падает. Из культуральной жидкости целевой продукт выделяют или в виде лимонной кислоты, или в виде цитрата натрия в зависимости от pH культуральной жидкости.

Наиболее близким к предлагаемому способу выделения цитрата натрия является способ, описанный в работе Л.А.Раминя, М.Я.Озолинь. Получение цитратов из ферментационного раствора н-алканов (В сб. "Биосинтез оксикислот и кетокислот микроорганизмами", "Зинатне" 1984, стр. 35-41).

Способ включает отделение биомассы от ферментационного раствора фильтрацией, обесцвечивание нативного раствора углем, подтитровку раствора, упаривание, кристаллизацию и выделение кристаллов технического трехзамещенного цитрата натрия с последующей перекристаллизацией из воды. Перекристаллизацией не удается освободиться от сульфат-ионов (остается в 10 раз больше, чем допускается по ГОСТу N 22280-76 на цитрат натрия). Удаление сульфат ионов производят химическим способом (осаждением соединениями бария в солянокислой среде) и путем сочетания химического способа с процессом ионного обмена.

Однако авторы не приводят количественных данных об ионообменной очистке, но указывают, что способ требует доработки и упрощения.

Цитрат натрия из нативного раствора переводят в лимонную кислоту пропусканием раствора через катионит КУ 2-8. Подтитровкой полученного раствора лимонной кислоты гидроксидами, в частности натрия или калия, получают равнозамещенные соли лимонной кислоты щелочных металлов.

Недостатком этого способа является многостадийность получения лимонной кислоты из нативного раствора и ее последующего перевода в цитрат натрия, высокий удельный расход химикатов, применение дорогостоящего реактива (соединения бария). Кроме того, в нативном растворе, помимо сульфат-иона, присутствуют хлорид и трудноотделяемый фосфат-ион, однако авторы не обсуждают этот факт.

Задачей, на решение которой направлены предлагаемые объекты изобретения, является получение нового штамма-продуцента лимонной кислоты и разработка эффективного способа получения и выделения лимонной кислоты и цитрата натрия.

Технический результат, который может быть получен при использовании штамма-продуцента и предлагаемых способов, заключается в том, что штамм может расти на побочных продуктах и отходах производства этилового спирта, способы обеспечивают повышение объемной продуктивности аппаратов, упрощается выделение, повышается выход целевого продукта при одновременном повышении его качества.

Сущность предлагаемого первого объекта изобретения специально селекционированный штамм дрожжей Yarrowia lipolytica BKM Y-2820 Д продуцент лимонной кислоты.

В отличие от других штаммов дрожжей предлагаемый штамм способен расти и продуцировать лимонную кислоту в присутствии таких ингибиторов метаболизма, как низшие альдегиды, сложные эфиры, сивушные масла (спирты средней длины цепи).

Сущность другого объекта изобретения способа получения лимонной кислоты заключается в том, что культивируют штамм Yarrowia lipolytica BKM Y-2820 Д, используя в качестве источника углерода побочные продукты или отходы производства этилового спирта, в частности головную фракцию производства спирта, сырец синтетического спирта или технический спирт, культивирование проводят в ферменте, причем при достижении в пермеате содержания лимонной кислоты не ниже 70 г/л или цитрата натрия не ниже 94 г/л, осуществляют отъем культуральной жидкости с клетками с последующим доливом среды до первоначального объема жидкости в ферментере или культивирование проводят в ферментере с мембранным модулем, при этом удаляют из ферментера пермеат непрерывно или периодически.

Указанные побочные продукты или отходы производства этилового спирта наряду с этиловым спиртом содержат значительное количество альдегидов и сложных эфиров. Так, головная фракция этилового спирта содержит в среднем 4,5 альдегидов, 3,8% сложных эфиров, 0,25% высших спиртов (в основном изоаниловый спирт), 1,5% метанола.

В процессе ферментации создаются условия, обеспечивающие высокую биосинтетическую активность продуцента лимонной кислоты, что достигается удалением из аппарата накопившегося продукта, ингибирующего собственный синтез, путем отъема культуральной среды вместе с клетками или удаления пермеата с помощью мембранного модуля. Отъем осуществляют преимущественно при достижении концентрации лимонной кислоты 70-130 г/л или концентрации цитрата натрия преимущественно 94-174 г/л.

Концентрация лимонной кислоты 70 г/л или концентрация цитрата натрия 94 г/л достаточна для химического выделения. При более низкой концентрации процесс выделения осложняется.

Одновременно с отъемом проводится подпитка клеток путем долива свежей среды. Таким путем поддерживается высокая продуктивность клеток в течение длительного времени и обеспечивается высокая объемная производительность аппарата (г/сутки•л или кг/сутки•м³). При производстве лимонной кислоты с помощью грибов из мелассы проводят отъем пермеата, содержащего лимонную кислоту, и долив сахаросодержащего раствора, при этом не происходит обновления мицеллия и повышения биосинтетической активности продуцента.

Отъем осуществляют преимущественно в объеме 20-80% от общего объема культуральной жидкости.

Предлагаемый штамм дрожжей Yarrowia lipolytica HMM 225 был депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов Российской Академии наук, проспект Науки 5, Пущино, Московская область, 142292, под номером BKM Y-2820 Д 12 июля 1996 года, в соответветствии с Будапештским договором о международной регистрации депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры.

Штамм Yarrowia lipolytica BKM Y-2820 Д получен в результате пересевов и последующего отбора из мутантного штамма продуцента лимонной кислоты из парафина Yarrowia lipolytica HMM 187. Отбор производился по признаку высокой активности биосинтеза лимонной кислоты из технического этанола и эфироальдегидной фракции.

Предлагаемый штамм может быть охарактеризован следующим образом.

Характеристика штамма.

Культурально-морфологические признаки.

3-суточная культура в жидком сусле и на агаризованном сусле представлена округлыми, овальными и слегка удлиненными клетками размером 4,0 6,5 x 4,5 - 13,0 μ. Встречаются мелкие клетки размером 2,0 2,5 x 3,0 3,5 m. Часть крупных клеток имеет неправильную форму. Почкование полярное и боковое. Клетки одиночные или соединенные в цепочки из 2-3 клеток.

Штрих на сусло-агаре (возраст 10 суток) сплошной, плоский, кремового цвета, гладкий, пастообразный, края ровные.

Колонии на сусло-агаре округлые диаметр большинства колоний 6 мм, встречаются мелкие колонии диаметром 3 мм (5-6% популяции).

Колонии беловато-кремового цвета, пастообразные, края ровные, центр колоний приподнят. У большинства колоний (90%) поверхность гладкая, у 10% колоний морщинистая.

Колонии на сусло-агаре (4 недели) кремового цвета, края бахромчатые, поверхность колонии шероховатая, пастообразная, центр колонии приподнят.

При росте в жидком сусле при температуре 25^oC на 2 сутки образуется пленка в виде тонкого налета, легко опадающая. Кольцо хорошо выражено.

Культура на стекле, картофельном агаре на 6 сутки образует псевдомицелий типа Candida, Mycocandida.

Спор не образует.

Физиологические и биохимические признаки.

Ассимилирует: глюкозу, D-галактозу (очень слабо), L-сорбозу, D-рибозу, этанол, глицерин, эритрит, адонит, D-маннит, сорбит, молочную, янтарную, лимонную, глюконовую кислоты.

Не ассимилирует: сахарозу, мальтозу, лактозу, целлобиозу, трегалозу, мелибиозу, раффинозу, мелицитозу, инулин, крахмал, D-ксилозу, L- и D-арабинозу, рамнозу, дульцит, инозит, D-глюкозамин, уроновую, 2-кетоглюконовую и 5-кетоглюконовую кислоты.

Строгий аэроб. Сахара не сбраживает.

Не ассимилирует нитраты.

Не растет в безвитаминной среде, нуждается в тиамине; в биотине не нуждается.

Не растет на среде с 50%-ной глюкозы.

Не растет при 37^oC. Максимальная температура роста 35^oC. Оптимальное pH 5,0-6,0.

Разжижает желатину. Гидролизует мочевину.

Продуцирует лимонную кислоту на глюкозе, глицерине, этаноле, уксусной кислоте, алканах, жирах.

Эти свойства идентичны тем, что описаны в определителе Kreger van Riy "The Yeast. A taxonomic study". 1984 для дрожжей вида Yarrowia lipolytica.

Принцип предлагаемого способа выделения основан на том, что от основного продукта цитрата натрия примеси (около 10%) отделяют, не изменяя форму цитрат-иона в растворе.

Способ выделения включает следующие стадии: освобождение от смеси сопутствующих ионов, путем обмена последовательно на катионите и анионите, обесцвечивание на ионосорбенте, упаривание, кристаллизацию и сушку.

В случае получения цитрата для фармацевтики и реактивных целей раствор пропускают дополнительно через слой активного угля для освобождения от белковых примесей.

Согласно предложенному способу нативный раствор, полученный после отделения биомассы, фронтальным методом в направлении снизу вверх со скоростью 0,15-0,3 см/мин, пропускают через последовательно соединенные две колонны, заполненные катионитом и анионитом соответственно. В качестве катионита может быть использован сульфокатионит КУ 2-8 в Na⁺ форме, в качестве анионита полифункциональная среднеосновная смола ЭДЭ-10П в цитратной форме.

Количество смолы, загруженной в каждую колонну, определяют, исходя из общего количества неорганических ионов и лимонной кислоты в нативном растворе, а также объемной емкости выбранного типа ионообменной смолы.

По предложенной схеме обессоливания в случае получения цитрата натрия через один объем катионита и анионита пропускают 46-49 объемов нативного раствора. При этом концентрация неорганических анионов в растворе после ионообменных смол составляет 12-14 мг/л, что примерно в 40 раз меньше, чем в исходном нативном растворе.

При пропускании нативного раствора через катионовую и анионитовую колонки на смолах происходит сорбция как катионов и анионов, так и части окрашенных компонентов. Ввиду того что выходящий из анионита раствор имеет желтоватый цвет, раствор обесцвечивают.

Обесцвечивание обессоленного раствора проводят пропусканием его через колонну, заполненную ионосорбентом ИА-1р в солевой форме. Для полного обесцвечивания раствора через один объем смолы можно пропускать до 36-38 объемов раствора. Полученный раствор имеет молокообразное окрашивание, что обусловлено наличием молекул белка (в частности, липазы). При обессоливании и обесцвечивании количество белка по сравнению с исходным снижается примерно в три раза (350 мг/л в нативном растворе, 103 мг/л в растворе после обработки смолами).

Для освобождения от остаточного количества белка раствор пропускают через слой активного угля толщиной 0,8-1,0 см. При этом через один объем угля пропускают до 26-29 объемов раствора. Для этой цели можно использовать обесцвечивающие активные угли марки ОУ-А или ОУ-В. Далее осветленный раствор подтитровывают раствором гидроксида натрия до pH 8,3, подвергают упариванию и двухступенчатой кристаллизацией выделяют кристаллы цитрата натрия.

Выбор типа ионообменной смолы обусловлен тем, что обе смолы (КУ-2-8 и ЭДЭ-10П) имеют высокую обменную емкость, химически прочны, легко подвергаются регенерации и удовлетворяют как технологическим, так и токсикогигиеническим требованиям.

Выбор осветляющей смолы обусловлен тем, что смола обладает хорошей обесцвечивающей способностью, механически прочна и легко отмывается от растворов кислоты и щелочи. Употребление этой смолы приводит к 6-8-кратному снижению количества используемого активного угля, который в конце цикла является отходом производства.

Предложенный способ выделения позволяет в укороченном цикле, минуя стадии получения лимонной кислоты, из нативного раствора с минимальным расходом щелочи с большой удельной производительностью ионообменных смол получать высокоочищенные равнозамещенные соли лимонной кислоты.

По предложенному технологическому подходу из нативного раствора для получения лимонной кислоты раствор вначале пропускают через катионит КУ-2-8 в H⁺ форме, а затем из раствора лимонной кислоты анионы минеральных кислот (HCl, H₂SO₄) отделяют пропусканием раствора через анионит ЭДЭ-10П в OH-форме. В этом цикле через один объем катионита КУ-2-8 можно пропускать 3,0-3,2 объема нативного раствора, а через анионит 15-17 объемов выходящей из катионитовой колонны раствора лимонной кислоты. Далее обессоленный раствор аналогично раствору цитрата подвергают обесцвечиванию на ионосорбенте ИА-1р и осветлению пропусканием раствора через слой угля.

Выделение кристаллов лимонной кислоты из обессоленного, обесцвеченного и осветленного раствора проводят известным способом путем вакуум-упаривания раствора до сухого веса, равного 69-72% и двухступенчатой кристаллизацией. При наличии изолимонной кислоты в целевом продукте проводят перекристаллизацию из воды.

Полученный продукт кислота лимонная моногидрат соответствует требованиям ГОСТ 365269 на пищевую лимонную кислоту.

Изобретения далее иллюстрируются следующими примерами, но не исчерпываются ими.

Пример 1. Штамм дрожжей Yarrowia lipolytica BKM Y-2820 Д поддерживают на косяках сусло-агара при температуре 28^oC, пересевая один раз в два месяца, между пересевами косяки хранят в холодильнике при температуре 4^oC. После 3 суток роста при температуре 28^oC клетки с двух косяков переносят в колбу объемом 750 мл, содержащую 100 мл среды следующего состава (г/л): (NH₄)₂SO₄ 3,0;
MgSO₄ • 7H₂O 0,7; Ca(NO₃)₂ 0,4; NaCl 0,5; K₂HPO₄ 0,1; KH₂PO₄ 1,0, дрожжевой экстракт 0,5, этанол 5,0: смесь микроэлементов (мг/л): KJ 0,1; B 0,01; Mn²⁺ 0,01, Cu²⁺ 0,01, Mo⁶⁺ 0,01, Fe² 0,05, Zn²⁺ 0,3.

Дрожжи выращивают на качалке (200 об/мин) при 28^oC в течение 24 часов.

Через 24 часа проводят второй пересев на среде того же состава, этанол вносят периодически (0,5% от объема среды исходно и по 0,5% по мере его потребления). Через 26 часов от начала второго пересева проводят подтитровку среды 10%-ным раствором NaOH до pH 5,0-6,0.

46-часовую культуру используют для инокулирования ферментов (10% от объема среды в ферментере) и проведения основной ферментации. Ферментацию проводят в 10-литровом ферментере АНКУМ-2М (производства Специального конструкторского бюро биологического приборостроения Российской Академии Наук).

Состав основной среды для ферментации (г/л): (NH₄)₂SO₄ 3,0; MgSO₄ • 7H₂O 1,4; NaCL 0,5; Ca(NO₃)₂ 0,8; K₂HPO₄ 0,2; KH₂PO₄ 2,0; ферментолизат 3,0; микроэлементы (мг/л): KJ 0,2; B 0,02; Mn²⁺ 0,02; Cu₂₊ 0,02; Mo⁶⁺ 0,02; Zn²⁺ 0,5; Fe²⁺ 0,3; тиамин 20 мкг, вода бидистиллированная, объем среды 6 литров. Этанол технический вносят в среду перед засевом (10 мл на 6 л среды) и далее по мере его потребления.

В процессе ферментации поддерживают температуру 28^oC. PO₂ - 20-25% от насыщения, pH 4,5 введением 20%-ного раствора NaOH.

Лимонную кислоту определяют двумя методами: химическим (Жаболовская Н.А. и др. Хлебопекарная и кондитерская промышленность, 5: 22-24, 1968) и энзиматическим (Methods of enzymatic food analysis, Boehringer Mannheim, p. 13-14, 1984), изолимонную кислоту энзиматическим методом (то же p. 31-32).

Через 72 часа культивирования, когда достигнута концентрация лимонной кислоты 70 г/л (цитрата натрия 94 г/л), к ферментеру подключают мембранный паростерилизуемый модуль с керамическими трубчатыми элементами (производство АО "Инжиниринг фильтр") и откачивают из аппарата примерно половину жидкости (3,7 л). Прозрачный пермеат передают на выделение целевого продукта.

К оставшейся концентрированной (уплотненной) культуре в ферментере доливают 3 л стерильной доливной среды следующего состава (г/л): MgSO₄•7H₂O 0,7; Ca(NO₃)₂ 0,4; NaCl 0,5; K₂HPO₄ 0,1; KH₂PO₄ 1,0; дрожжевой ферментолизат 3,0; технический этиловый спирт вносят как описано выше; микроэлементы (мг/л): Kl 0,1; B 0,01; Mn²⁺ 0,01; Cu²⁺ - 0,01; MO⁶⁺ 0,01; Zn²⁺ 0,5; Fe²⁺ 0,3; тиамин 20 мкг;
Ферментацию продолжают в описанном режиме. Через каждые 72 часа операцию повторяют: откачку пермеата и долив 3 л свежей среды (до постоянного объема в ферментере 6 л). Концентрацию в пермеате лимонной кислоты поддерживают на уровне 70-90 г/л, или цитрата натрия 94-121 г/л. Продолжительность ферментации 18 суток (432 часа). За это время в среде накапливается 1805,5 г лимонной кислоты, выход от потребленного этанола 78% что соответствует 2425,9 г цитрата натрия, выход 104,8% средний съем с аппарата за одни сутки 100,3 г кислоты или 134,8 г цитрата натрия.

Пример 2. Ферментацию проводят так же, как в примере 1, за исключением того, что через 60 часов после начала культивирования к ферментеру подключают мембранный модуль на полых волокнах (установка ГосНИИбиотехника) и осуществляют непрерывную откачку пермеата и соответствующий автоматический долив свежей доливной среды так, чтобы поддержать постоянный объем среды в ферментере 6 л. В течение всей ферментации, продолжающейся более 12 суток (308 часов), поддерживают концентрацию лимонной кислоты в отходящем пермеате на постоянном уровне 70-80 г/л (цитрат натрия 94,1-107,5 г/л), при этом изменяют проток свежей среды с 230 мл/час в начале процесса до 70 мл/час в конце процесса. Состав доливной среды такой же, как в примере 1.

За 308 часов ферментации получают 2421,6 г лимонной кислоты, выход 80% или 3254,6 г цитрата натрия с выходом 107,5% средний съем за сутки с аппарата 189,2 г кислоты или 254,3 г цитрата натрия.

Пример 3. Ферментацию в течение первых 72 часов проводят, как в примере 1, за исключением того, что при достижении концентрации лимонной кислоты 70 г/л проводят отъем (без мембранного биологического модуля) 20% культуральной жидкости, доливают в аппарат свежую доливную среду (1,2 л) до первоначального объема 6 л и продолжают ферментацию. Отъемы культуры и доливы свежей среды повторяют регулярно через 24 часа. Концентрация лимонной кислоты в сливаемой жидкости 80 г/л, общая продолжительность ферментации 15 суток. Состав доливной среды (г/л): (NH₄)₂SO₄ 3,0; MgSO₄•7H₂O 0,7; Ca(NO₃)₂ 0,4; NaCl 0,5;
K₂HPO₄ 0,1; KH₂PO₄ 1,0; автолизат дрожжей 27 мл, микроэлементы (мг/л): Kl 0,1; B 0,01; Mn²⁺ 0,01; Cu²⁺ 0,01; Mo⁶⁺ 0,01; Zn²⁺ 1,0; Fe²⁺ 0,6; тиамин 20 мкг.

Слитую культуральную жидкость освобождают от клеток дрожжей сепарацией, пермеат передают на выделение продукта, концентрация лимонной кислоты 80 г/л.

За 15 суток ферментации получают 2301 г лимонной кислоты, что соответствует 3095 г цитрата натрия, средний съем за сутки лимонной кислоты - 153,4 г или цитрата натрия 206,2 г.

Пример 4. Ферментацию проводят, как описано в примере 3, за исключением того, что отливают 50% культуральной жидкости, вносят в доливную среду до общего объема в аппарате 6 л и продолжают ферментацию. Отъемы культуры и доливы свежей среды повторяют регулярно через каждые 48 часов, при этом концентрация лимонной кислоты в сливаемой жидкости 80-86 г/л; общая продолжительность ферментации 15 суток.

За 15 суток ферментации получают 2660 г лимонной кислоты, что соответствует 3575 г трехзамещенного цитрата натрия, средний съем за сутки лимонной кислоты 177,3 г или 238,3 цитрата натрия.

Пример 5. Ферментацию проводят, как в примере 4, за исключением того, что отъемы культуры и доливы свежей среды повторяют регулярно через каждые 72 часа, при этом концентрация лимонной кислоты в сливаемой жидкости 95-115 г/л, общая продолжительность ферментации 15 суток.

За 15 суток ферментации получают 2620 г лимонной кислоты, что соответствует 3521,3 г цитрата натрия, средний съем за сутки с аппарата - 174,7 г кислоты или 234,8 г цитрата натрия.

Пример 6. Ферментацию проводят, как в примере 5, за исключением того, что в качестве сырья используют сырец спирта этилового синтетического. Концентрация лимонной кислоты в сливаемой жидкости 92-117 г/л. За 15 суток ферментации получают 2700 г лимонной кислоты, что соответствует 3629 г цитрата натрия, средний съем с аппарата за сутки 180 г кислоты или 242 г цитрата натрия.

Пример 7. Ферментацию проводят, как в примере 5, за исключением того, что концентрации (NH₄)SO₄ в доливной среде 4,0 г/л. За 15 суток ферментации получают 2985 г лимонной кислоты, что соответствует 4012 г цитрата натрия, средний съем с аппарата за сутки 165,8 г кислоты или 222,8 г цитрата натрия.

Пример 8. Ферментацию проводят, как в примере 7, за исключением того, что в качестве сырья используют фракцию головного этилового спирта (эфироальдегидную фракцию).

Продолжительность ферментации 18 суток. Концентрация лимонной кислоты 120-130 г/л цитрата натрия 161-174,7 г/л.

За ферментацию получают 3127 г лимонной кислоты, что соответствует 4203 г цитрата натрия, средний съем за сутки с аппарата 173,7 г лимонной кислоты или 221 г цитрата натрия.

Пример 9. Ферментацию проводят, как в примере 5, за исключением того, что отливают 80% культуральной жидкости, через 3 суток после долива свежей среды концентрация лимонной кислоты в среде 80-89 г/л или цитрата натрия - 107,5-119,6 г/л.

За 15 суток ферментации получают 2554 г лимонной кислоты, что соответствует 3432 г трехзамещенного цитрата натрия, средний съем с аппарата за сутки 170,3 г лимонной кислоты или 228,9 г цитрата натрия.

Пример 10. Посевной материал в колбах выращивают, как описано в примере 1, за исключением того, что 46-часовую культуру в колбах (2 л культуры) используют для инокулирования ферментера объемом 35 л, содержащего 20 л питательной среды следующего состава (г/л): (NH₄)₂SO₄ - 3,0; MgSO₄•7H₂O 0,7; Ca(NO₃)₂ 0,4; NaCl - 0,5; K₂HPO₄ 0,1; KH₂PO₄ 1,0, этанол технический 2,2 мл, автолизат дрожжей 27 мл, микроэлементы (мг/л): KJ - 0,2, B 0,02, Mn²⁺ 0,02, Mo⁶⁺ 0,02, Cu²⁺ 0,02, Zn²⁺ 0,5, Fe²⁺ 0,3, тиамин 20 мкг.

В процессе выращивания в 35-литровом ферментере поддерживают температуру 28^oC, pH 5,0, pO₂ 20-25% от насыщения, этанол технический вносят по мере его потребления. Через 24 часа культивирования всю культуру (20 л) передают в качестве инокулята в производственный ферментер объемом 500 л, содержащий 250 л стерильной питательной среды.

Производственный ферментр соединен с выносным паростерилизуемым мембранным модулем, фильтрующими элементами, которого являются керамические трубчатые элементы с нанесенным слоем окиси кремния. В качестве насоса используют паростерилизуемый мембранный насос с пневмоприводом.

Состав питательной среды для проведения ферментации в 500-литрвом ферментере (г/л): (NH₄)₂SO₄ 3,0, MgSO₄•7H₂O 1,4, Ca(NO₃)₂ 0,8, NaCl 0,5, KH₂PO₄
2,0, K₂HPO₄ 0,2, автолизат дрожжей 27 мл, этанол технический 2,8 мл, микроэлементы (мг/л): KJ 0,2; B 0,02, Mn²⁺ 0.02, Mo⁶⁺ 0,02, Cu²⁺ 0,02, Zn²⁺ 0,5, Fe²⁺ 0,3.

В процессе ферментации поддерживают температуру 28^oC, pH 4,5 путем введения 30%-ного раствора NaOH, pO₂ 20-25% от насыщения, давление 0,5 0,6 ати.

Культивирование дрожжей и биосинтез лимонной кислоты проводят в полунепрерывном режиме в условиях отъемов и доливов. Через 72 часа ферментации при достижении концентрации лимонной кислоты 70-75 г/л сливают с использованием мембранного модуля 12 л пермеата и доливают 12 л доливной среды. Отъем нативного раствора (12-15 л) через модуль и долив свежей среды производят далее через каждые 5 часов. Ежесуточный съем нативного раствора 60 л, его собирают и передают для выделения целевого продукта. Процесс ферментации с отъемами-доливами продолжают 20 суток.

Состав среды для доливов (г/л): MgSO₄•7H₂O 0,7, Ca(NO₃)₂ 0,4, NaCl 0,5, K₂HPO₄ 0,1, KH₂PO₄ 1,0, автолизат дрожжей 25 мл, этанол технический - 2,8 мл (далее по мере потребления), микроэлементы (мг/л): KJ 0,2, B 0,02, Mn²⁺, Mo⁶⁺ 0,02, Cu²⁺ 0,02, Zn²⁺ 1,0, Fe²⁺ 0,6, тиамин 20 мкг.

Ферментацию в описанном режиме проводят в течение 20 суток. В пермеате концентрация лимонной кислоты 70-80 г/л или цитрата натрия 94-107,5 г/л. За это время получают 94 кг лимонной кислоты, что соответствует 126,3 кг цитрата натрия. Средняя суточная производительность аппарата 4,7 кг кислоты или 6,32 кг цитрата натрия, что соответствует 18,8 кг кислоты в сутки на 1 м³ исходной среды или 25,3 кг цитрата натрия на 1 м³ среды в сутки.

Пример 11. Ферментацию проводят, как в примере 10, за исключением того, что через 72 часа ферментации в 500-литровом ферментере, когда концентрация лимонной кислоты достигает 71 г/л, отливают культуральную жидкость с клетками дрожжей без подключения мембранного модуля.

Учитывая, что исходный объем среды в аппарате 250 л, сливают среду с клетками так, чтобы в аппарате осталось 125 л культуральной среды, и вносят 125 л свежей питательной среды и продолжают ферментацию в том же режиме.

Через 48 часов ферментации опять достигается концентрация лимонной кислоты 70-75 г/л. Проводят следующий отъем, оставляя в аппарате 125 л культуры и доливая 125 л доливной среды. Состав среды долива такой же, как в примере 9.

Ферментацию в описанном режиме проводят в течение 11 суток, осуществляя четыре операции отъема-долива.

Концентрация лимонной кислоты в пермеатах 70-75 г/л или цитрата натрия 94-100 г/л. В процессе ферментации с аппарата получают 67,5 кг лимонной кислоты или 90,7 кг цитрата натрия. Средняя суточная производительность аппарата 6,14 кг кислоты или 8,25 кг цитрата натрия, что соответствует 24,5 кг кислоты в сутки на 1 м³ исходного объема среды или 33 кг цитрата натрия в сутки на 1 м³ среды.

Пример 12. Выделение натрия лимонно-кислого. Нативный раствор лимонной кислоты, полученный после отделения биомассы от ферментационного раствора микрофильтрацией в количестве 9,0 л, содержащий 102,5 г/л лимонной кислоты, со скоростью 0,2 см/мин пропускают через последовательно соединенные три колонны.

Колонны заполнены катионитом КУ-2-8 в Na⁺ форме, анионитом ЭДЭ-10П в цитратной форме и ионосорбентом ИА-1р в солевой форме соответственно. После завершения подачи нативного раствора батарею ионообменных колонн промывают водой до содержания лимонной кислоты в выходящей с последней колонны жидкости, равного 2,5 г/л. На промывку смол расходуют 0,8 л воды, которую объединяют с основным раствором.

Для осветления обессоленного раствора его пропускают через слой активного угля толщиной 1 см. Угольный слой после окончания фильтрации промывают подогретой до 60^oC (0,2 л) водой. Промывные воды также объединяют с основным раствором.

pH раствора подтитровкой 40% -ным раствором едкого натра доводят до значения 8,3. Далее подтитрованный раствор трехзамещенной натриевой соли лимонной кислоты подвергают вакуум-упариванию до появления первых кристаллов в растворе (до концентрации цитрата натрия и раствора, равной 530 г/л). После этого упаренный раствор переводят в кристаллизатор и с перемешиванием в течение 1 ч раствор охлаждают до 11^oC и выдерживают при этой температуре в течение 4 ч. Выпавшие кристаллы из раствора отделяют фильтрацией.

Кристаллы подвергают высушиванию при 45-47^oC до постоянного веса, а маточный раствор вновь упаривают до появления кристаллов в растворе и аналогично тому, как на первой ступени кристаллизации, выделяют вторую порцию кристаллов цитрата натрия.

Вес высушенных кристаллов двухводного цитрата натрия из первой порции составляет 987,8 г, а из второй 336,6 г.

Объем маточного раствора составляет 245 мл с содержанием изолимонной кислоты 186,6 г/л, а лимонной кислоты 123,0 г/л.

Содержание трехзамещенной натриевой соли изолированной кислоты в полученных первой и второй порциях кристаллов в среднем 1,6%
Очистку кристаллов цитрата натрия от кристаллов изоцитрата проводят перекристаллизацией из воды известным способом.

Для этого в подогретой до 70^oC воде объемом 1100 мл при перемешивании растворяют 1320 г технического цитрата натрия и после 40-минутной выдержки температура со скоростью 0,35^oС/мин снижается до 10^oC и раствор выдерживают при этой температуре еще 120 мин. Выпавшие из раствора кристаллы отделяют фильтрацией.

Вес высушенных кристаллов трехзамещенной натриевой соли лимонной кислоты двухводной составляет 615 г.

Полученный продукт по показателям соответствует требованиям ГОСТ 22280-76 на натрий лимонно-кислый (за исключением того, что содержание кристаллизационной воды снижено с 5,5 молекул до 2 молекул).

Объем маточного раствора, содержащего лимонную кислоту в количестве 265 г/л и изолимонную кислоту 14,8 г/л, составляет 1685 мл. Из маточного раствора аналогично первой ступени кристаллизации путем упаривания, кристаллизации, фильтрации и сушки получают 96-97%-ной чистоты 582 г кристаллов трехзамещенной натриевой соли лимонной кислоты двухводной.

Выход конечного продукта натрия лимонно-кислого трехзамещенного с двумя молекулами кристаллизационной воды (с учетом возврата маточного раствора в технологический цикл) составляет 85,6% Из них 43,6% с содержанием основного вещества не менее 99% рекомендуется использовать в фармацевтической, химической и пищевой промышленности, а остальную часть с содержанием основного вещества не менее 96-97% в производстве моющих средств.

Пример 13. Способ выделения осуществляют аналогично описанному в примере 12, за исключением того, что подтитровку осветленного раствора 40%-ным раствором едкого натра проводят до pH раствора, равного 5,5.

После упаривания, кристаллизации, фильтрации и сушки получают двухзамещенную соль лимонной кислоты.

Пример 14. Ферментацию проводят, как в примере 10. Затем отбирают 60 литров пермеата с содержанием 70 г/л лимонной кислоты для ее выделения.

Проводят подготовку колонок со смолой КУ-2-8 в H⁺ форме и с ЭДЭ-10П в OH⁺ форме. Нативный раствор пропускают через последовательно соединенные три колонки с КУ-2-8, ЭДЭ-10П и ионосорбентом ИА-1р в солевой форме со скоростью 10-11 л/час. Собирают фракции с pH от 2,5 до 3,5.

После завершения подачи нативного раствора батарею ионообменных колонн промывают водой до тех пор, пока в растворе, поступающем с последней колонки, содержание лимонной кислоты не будет равно 2,5 г/л. Суммарные фракции объемом 53,3 л с целью освобождения от взвесей (белков) под вакуумом отфильтровывают через угольную подушку (толщина слоя угля 0,8-1,0 см). Отфильтрованный раствор выпаривают под разрежением 80-90 кПа и температуре не выше 55^oC до плотности концентрированного раствора 1,38 г/см³. Концентрированный раствор охлаждают за 25 минут до температуры 37^oC, вводят затравку кристаллов лимонной кислоты. Кристаллизацию ведут по следующему режиму: охлаждение от 37^oC до 27^oC за 1 час, охлаждение от 27^oC до 20^oC за 55 минут, охлаждение от 20^oC до 10^oC за 3,5 часа. Для созревания кристаллов их выдерживают с перемешиванием в течение 4 часов.

Отделение кристаллов проводят на нутч-фильтре с разряжением 90 кПа фильтрующий элемент лавсан. Кристаллы дополнительно промывают охлажденной до 8^oC дистиллированной водой и повторно фильтруют. Маточник обрабатывают при 70^oC в течение 30 минут активным углем в количестве 0,1% от расчетного количества лимонной кислоты в концентрате, затем обрабатывают по описанной выше процедуре.

Сушку продукта проводят в сушильном шкафу при температуре 50^oC при периодическом взрыхлении кристаллов и перемешивании. Время сушки 20-30 минут. Суммарно получают 3,77 кг 99,5% моногидрата лимонной кислоты.

Таким образом, предлагаемые в данном изобретении штамм-продуцент лимонной кислоты и способ получения лимонной кислоты путем его культивирования позволяет использовать в качестве сырья для производства лимонной кислоты и цитрата натрия не только пищевой спирт, но и отходы или побочные продукты производства этилового спирта, а именно головную фракцию производства спирта, сырец синтетического спирта и технический спирт. Микробиологический синтез лимонной кислоты и цитрата натрия из побочных продуктов производства этилового спирта обеспечивает утилизацию этих отходов, расширяют сырьевую базу производства кислоты и ее соли, снижает себестоимость целевых продуктов.

Предлагаемый способ получения лимонной кислоты как отъемно-доливным способом, так и с использованием мембранных фильтрующих модулей позволяет поддерживать в течение длительного времени высокую биосинтетическую активность продуцента. В результате достигается высокая объемная производительность ферментационного аппарата (27-30 кг лимонной кислоты/сут•м³, что соответствует 37-40 кг цитрата натрия/сут•м³). Кроме того, сокращаются затраты на подготовку посевного материала и ферментационного оборудования. Одновременно в ходе культивирования штамма-продуцента поддерживается высокая концентрация лимонной кислоты (70-136 г/л) или цитрата натрия (94-180 г/л) на протяжении всего непрерывного процесса ферментации, который может продолжаться 15-18 и даже 30 суток.

Предлагаемый метод выделений лимонной кислоты и цитрата натрия обеспечивает получение продуктов высокой квалификации, является простым и высокоэффективным. Лимонная кислота и цитрат натрия, полученные этим методом, отвечают требованиям ГОСТ 3652-69 и ГОСТ 22280-76 соответственно.

Предлагаемые способы особенно важны для производства цитрата натрия, поскольку существующий традиционный метод его получения сложен, что сдерживает объем производства этой соли. Цитрат натрия в первую очередь является необходимым компонентом экологически безопасных бесфосфатных моющих средств.

Использование: биотехнология, получение лимонной кислоты. Сущность изобретения: новый штамм дрожжей Jarrowia lipolytica BKM Y-2820Д, способ получения лимонной кислоты и способ выделения цитрата натрия. В качестве источника углерода при культивировании указанного штамма используют побочные продукты или отходы производства этилового спирта, при этом процесс ведут в ферментере с отъемом культуральной жидкости и доливом питательной среды или в ферментере с мембранным модулем с удалением пермеата непрерывно или периодически. Способ выделения включает следующие стадии: освобождение от смеси сопутствующих ионов путем пропускания раствора через сильнокислотный катионит в солевой форме и среднеосновной анионит в цитратной форме, обесцвечивание полученного раствора с помощью осветляющего ионосорбента в солевой форме, упаривание, кристаллизацию и сушку. 3 с. и 3 з.п. ф-лы.

1. Штамм дрожжей Yarrowia lipolytica ВКМ Y-2820 D-продуцент лимонной кислоты. 2. Способ получения лимонной кислоты, включающий культивирование штамма дрожжей Yarrowia lipolytica при аэробных условиях на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, фосфора и микроэлементы, с последующим отделением биомассы и выделением целевого продукта в виде кислоты или цитрата натрия, отличающийся тем, что культивируют штамм Yarrowia lipolytica ВКМ Y-2820 D, при этом используют в качестве источника углерода побочные продукты или отходы производства этилового спирта, в частности головную фракцию производства спирта, или сырец синтетического спирта, или технический спирт, культивирование проводят в ферментере, причем при достижении содержания лимонной кислоты не ниже 70 г/л или соответственно цитрата натрия не ниже 94 г/л осуществляют отъем культуральной жидкости с клетками с последующим доливом среды до первоначального объема жидкости в ферментере или культивирование проводят в ферментере с мембранным модулем и удаляют из фермента пермеат непрерывно или периодически. 3. Способ по п.2, отличающийся тем, что осуществляют отъем культуральной жидкости с клетками в объеме 20 80% от общего объема культуральной жидкости. 4. Способ выделения цитрата натрия из пермеата или нативного раствора, полученного после отделения биомассы из культуральной жидкости, включающий обессоливание раствора от смеси сопутствующих ионов путем ионного обмена, обесцвечивание, упаривание и кристаллизацию, отличающийся тем, что обессоливание нативного раствора при pН 4,5 8,5 проводят путем пропускания раствора последовательно через сильнокислотный катионит в солевой форме и среднеосновной анионит в цитратной форме, а обесцвечивание полученного раствора проводят осветляющим ионосорбентом в солевой форме. 5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что в качестве сильнокислотного катионита используют катионит КУ-2-8, в качестве среднеосновного анионита - анионит ЭДЭ-10П, в качестве осветляющего ионосорбента ионосорбент ИА-1р. 6. Способ по п. 4, отличающийся тем, что дополнительное обесцвечивание для отделения остаточных белковых примесей осуществляют пропусканием раствора через слой активного угля.