Способ получения лимонной кислоты Советский патент 1982 года по МПК C12D1/04 

Рост по штриху плоский, гладкий, мато вый, кремового цвета, края ровнце. Культура на стекле на картофельном агаре: псевдомицелий слабо развит. Стро гий аэроб. Сахара не сбраживает. Ассими лирует глюкозу, этанол, ацетат, глицерин Слабый рост на галактозе. Не ассимилирует лактозу, мальтозу сахарозу, рафинозу, арабинозу, ксилозу крахмал. Использует (NH4)2S04 и NH4CI в качестве источника азота. На нитратах не растет. Молоко иептонизирует полностью. Оптимальная температура роста 26- 30°С, максимальная - 33°С. Хранится на агаризованной среде Ридер с парафином и в ампулах в диофилизированном состоянии. Описанный штамм Candida lipolytica НМ.М.-187 характеризуется способностью при росте на средах с м-алканами продуцировать преимущественно одну лимонную кислоту, изолимонная кислота практически не накапливается. Для оценки стабильности мутанта Candida lipolytica НММ-187 его пересевают в течение 4 месяцев на свежую среду с парафином (культивирование в колбах на качалке), в обш,ей сложности проведено 40 последовательных пассажей. За время частых пересевов культура не только не утрачивает способно.сть продуцировать преимущественно цитрат, но соотношение циТраТ: изоцитрат в среде еще более сдвигается в сторону преимущественного накоплений Цитрата (от 8:1 до 12: 1). Хранение мутантного штамма в течение 4 лет на агаризованной среде с парафином также не ухудшает свойств этой культуры. Мутантный штамм Candida lipolytica НММ-187 при всех испытаниях обнаруживает стабильность основного практически важного свойства - преимущественный синтез цитрата на средах с к-алканами. Пример 1. Дрожжи Candida lipolytica НММ-187 поддерживают на агаризованной минеральной среде Ридер с нормальными парафинами (Ci2-Cig), имеющей следующий состав, г/л: Нормальные парафины10,0 (Ci2С э) (NH4)2043,0 MgSO4-7H2O0,7 NaCl0,5 Са(ЫОз)20,4 КН2РО41,0 К2НРО40,1 Дрожжевой автолизат2,0 мл Набор микроэлементов по Буркгольдеру Агар-агар25,0 Набор микроэлементов по Буркгольдеру включает следующие компоненты (мг/л среды): KJ 0,1; В 0,01; Мп 0,01; Zn2+ 0,01; 0,01; Мо 0,01; Ре2+ 0,05. Дрожжи выращивают на косяке в течение 3 суток при 28.. Суспензию клеток с агаризованной среды переносят в колбы объемом 750 мл, содержащие 50 мл посевной среды. Состав посевной среды, г/л: Нормальные парафины48,0 (NH4)2S043,0 MgS04-7H200,7 NaCl0,5 Са(ЫОз)20,4 КН2Р041,0 К2НР040,1 Дрожлсевой автолизат4,0 мл Набор микроэлементов по Буркгольдеру. Через 48 ч инкубации на качалке полученную посевную культуру переносят в новую партию колб с посевной средой, объем инокулума 6% от объема среды. Вторую партию колб помещают на качалку при 28-30°С; во время культивирования, продолжавшегося 50 ч, рН среды поддерживают на уровне 6,0-6,5 введением стерильного 10%-ного раствора КаОН. 500 мл выросшей культуры переносят в ферментационную среду. Объем - среды 3,5 л. Состав ферментационной среды, г: Нормальные парафи 1ы 600 (Ci2-Cig) (NH4)2S0420,0 MgS04-7H2O2,8 г NaCl1,5 Са(ЫОз)21,6 KH2PO44,0 K2HP040,4 Дрожжевойавтолизат 8,0 мл Ферментацию проводят в ферметационном аппарате АНКУМ-2 объемом 10 л. Процесс осуществляется при 29-30°С в словиях интенсивного перемешиваиия и аэраЦии среды воздухом. Концентрацию ислорода в среде поддерживают 75-85% асыщения. рН среды регулируют введением раствора iNaOH на уровне 6,,5. Максимальная концентрация клеток проуцента на третьи сутки ферментации остигает 13 г/л. Через 144 ч культивирования достигают онцентрации лимонной кислоты 217 г/л, дновременно в среде накапливается изоимонная кислота, ее концентрация 6 г/л. В аппарате общее содержание лимонной ислоты безводной - 868 г или моногидраа 949,2 г. Ферментационный выход безводой лимонной кислоты по весу составляет 45% и моногидрата 158% от внесенных арафинов. Пример 2. Посевной материал i,iu7o от объема среды), приготовленный анало гично примеру 1, размиожают последовательно в ферментаторах емкостью 63 л и 400 л на среде следующего состава, г/л: Нормальные парафины48 (0)2Cjg) (ЫП4)25046,0 MgSOi-THaO0,7 NaCl0,5 Са(МОз)20,4 КП2Р041,0 К2НР040,1 Дрожжевой автолизат2,0 Набор микроэлементов по Буркгольдеру. Концентран,ия клеток продуцента (по сухому весу) достигает 30 г/л. Длительность процесса в каждом ферментаторе 48 ч при температуре 28-30°С и рН 5,0-5,5. Основную ферментацию осуществляют в ферментаторе емкостью 3000 л. Коэффициент заполнения аппарата 0,6. Посевной материал вносят в ферментатор в количестве 10% от объема среды. Состав ферментационной среды, г/л: Нормальные парафины (Ci2-Cig) (NH4)2S04 MgS04-7H2O Са(ЫОз)2 KH2P04 K2HPO4 Дрожжевой автолизат Набор микроэлементов по Буркгольдеру. Ферментацию проводят при 28-30°С. рН среды поддерживают на уровне 5,6-6,0 введением стерильного 20%-ного раствора NaOH. Концентрацию кислорода в ферментационной среде поддерживали первые сутки 50-60%, вторые-четвертые сутки увеличивают до 80% и на пятые сутки снижают до 50%. В течение процесса ферментации на. вторые-четвертые с промежутком в 24 ч добавляют в фермеитационную среду нормальные парафины, каждая порция составляла 2% от объема среды. Максимальная концентрация клеток продуцента на вторые-третьи сутки ферментации 20 г/л. Продолжительность основной ферментации 120 ч. К концу ферментации общее содержание лимонной кислоты в аппарате 368 кг. Ферментациоииый выход безводной кислоты составляет 128% по весу от внесенных парафинов. Использование иредложеииого способа позволяет иаладить производство лимонной кислоты из непищевого сырья - нормальных парафинов - с более высоким выходом, чем по известным способам. Себестоимость лимонной кислоты, полученной по данному способу, значительно ниже себестоимости этой кислоты, полученной из мелассы. Формула изобретения Способ получения лимонной кислоты путем культивирования продуцирующих ее дрожжей вида Candida lipolytica в условиях аэрации на питательной среде, содержащей нормальные парафины в качестве источника углерода, источник азота, минеральные соли с последующим выделением целевого продукта из культуральной жидкости, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода лимонной кислоты, из вида Candida lipolytica используют щтамм Candida lipolytica НММ-187, при этом культивирование ведут ири концентрации клеток продуцента 10-30% по сухому веществу, рН 5,5-6,5 и концентрации кислорода, равной 50-80% насыщения. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Патент СССР № 448652, кл. С 12D 1/04, опублик. 1974.