СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ Российский патент 2007 года по МПК C12P7/48 C12N1/14 C12R1/685 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к производству лимонной кислоты непрерывной глубинной ферментацией углеводсодержащего сырья различного состава с помощью гриба - продуцента Aspergillus niger.

Известен способ производства лимонной кислоты путем выращивания продуцирующих ее плесневых грибов в питательной среде, содержащей источник углерода, азота, минеральные соли, с последующим выделением лимонной кислоты из культуральной жидкости. Недостатками данного способа являются ведение процесса ферментации в периодическом режиме, короткая продолжительность периода активного кислотообразования у гриба, частые перезарядки ферментаторов и большой расход посевного материала (Технологическая инструкция по производству пищевой лимонной кислоты. - Ленинград, 1981).

Наиболее близким к предложенному по своей технической сущности является способ получения лимонной кислоты, включающий постадийную ферментацию гриба Aspergillus niger в батарее последовательно соединенных ферментаторов, на каждой стадии поддерживают условия, необходимые для роста гриба и кислотообразования, путем подачи необходимого количества питательной среды, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли, при этом на конечной стадии процесса в культуральную жидкость добавляют нейтрализующее вещество, в качестве которого используют едкую щелочь, и производят возврат части культуральной жидкости (культуры гриба) на первую стадию процесса (а.с. СССР №432186, С12D 1/04, 1974).

Недостатком известного способа является низкая активность процесса биосинтеза и дополнительные затраты на введение нейтрализующего вещества, что вызвано возвратом части неактивной культуры гриба из конечной стадии процесса на первую и подачей питательной среды со скоростью, не учитывающей общую активность мицелия на каждой стадии и в целом в батарее ферментаторов.

Поскольку в известном способе предусмотрено использование батареи последовательно соединенных ферментаторов, то это приводит к нестабильности условий биосинтеза лимонной кислоты в каждом аппарате и снижению производительности батареи в целом и в конечном итоге к снижению выхода лимонной кислоты. Кроме того, присутствует высокий уровень инфицирования процесса ферментации, в частности, дрожжевой микрофлорой, за счет того что аппаратурное оформление процесса не позволяет исключить инфицированный ферментатор из батареи, что также подавляет процесс биосинтеза лимонной кислоты.

Задача изобретения заключается в повышении выхода лимонной кислоты за счет обеспечения стабилизации параметров процесса биосинтеза (концентрация кислот, биомасса продуцента, остаточный сахар) на одном уровне в каждом аппарате батареи и увеличении длительности непрерывного процесса биосинтеза лимонной кислоты.

Поставленная задача решена тем, что в известном способе получения лимонной кислоты, включающем непрерывную постадийную ферментацию гриба Aspergillus niger на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли в батарее ферментаторов, поддерживая на каждой стадии условия, необходимые для роста гриба и кислотообразования, путем подачи необходимого количества питательной среды, сначала проводят процесс ферментации в периодическом режиме в ферментаторах, в количестве не менее 3-х, один из которых головной, до достижения в головном ферментаторе концентрации органических кислот в пределах 110-130 г/дм³ и концентрации сахара 3-5 г/дм³, а в остальных 80-90 г/дм³ и 10-12 г/дм³ соответственно, а процесс непрерывной ферментации осуществляют в две стадии в батарее ферментаторов, соединенных параллельно с головным ферментатором, поддерживая на каждой стадии концентрацию органических кислот и концентрацию сахара в культуральной жидкости, достигнутые до перевода в непрерывный режим ферментации, а вязкость в пределах 0,04-0,05 Па·с и воздушно-сухую биомассу в пределах 12-16 г/дм³ путем периодических отъемов культуральной жидкости с концентрацией сахара 3-5 г/дм³ из головного ферментатора в сборник растворов и из остальных ферментаторов с концентрацией сахара 10-12 г/дм³ в головной ферментатор с последующим доливом в них питательного раствора и стерильной воды.

В ходе процесса ферментации в непрерывном режиме дополнительно вводят источники углеводов и минеральные соли.

Технический результат изобретения, заключающийся в повышении выхода лимонной кислоты, достигается за счет ведения процесса ферментации сначала в периодическом режиме, а затем перевода процесса ферментации в непрерывный режим и ведения процесса в две стадии, в батарее параллельно соединенных ферментаторов, один из которых, головной, служит для утилизации субстрата и завершения процесса ферментации, а остальные ферментаторы - для осуществления основного процесса биосинтеза при достижении и сохранении заявленных показателей процесса ферментации. Ведение процесса по такой схеме обеспечивает стабилизацию параметров процесса биосинтеза, повышает производительность батареи и, следовательно, выход лимонной кислоты. Количество ферментаторов в батарее определяется объемом головного ферментатора.

Пример 1.

Стерильную мелассную среду, содержащую: сахарозу - 30,0 г/дм³, КН₂PO₄ - 0,16 г/дм³, NH₄Cl - 2,2 г/дм³, MgSO₄·7H₂O - 0,25 г/дм³, ZnSO₄·7Н₂О - 0,005 г/дм³, засевают спорами гриба Aspergillus niger штамм ВКПМ F-171. Подращивание осуществляют в условиях аэрации при температуре 36°С в течение 24 ч. Подрощенный мицелий используют в качестве посевного материла для ферментации.

Ферментацию проводят в 4-х ферментаторах емкостью 30 дм³ на мелассной питательной среде следующего состава: сахароза - 30,0 г/дм³; NH₄Cl - 1,7 г/дм³; КН₂PO₄ - 0,12 г/дм³; ZnSO₄·7Н₂О - 0,005 г/дм³.

Сначала посевным мицелием засевают головной аппарат. Через 24 ч в него вводят питательную мелассную среду с концентрацией сахара 180 г/дм³ и ведут процесс ферментации в периодическом режиме 5-6 суток в соответствии с инструкцией (Технологическая инструкция по производству пищевой лимонной кислоты. - Ленинград, 1981). Через 48 ч после засева головного ферментатора одновременно засевают вновь выращенным посевным мицелием остальные три ферментатора. Через 24 ч в них вводят питательный мелассный раствор с концентрацией сахара 180 г/дм³ и ведут ферментацию в периодическом режиме 4-5 суток в соответствии с вышеуказанной инструкцией. Процесс ведут до достижения в головном аппарате концентрации органических кислот 110-130 г/дм³ и концентрации сахара 3-5 г/дм³, а в остальных трех аппаратах 80-90 г/дм³ и 10-12 г/дм³ соответственно. Затем ферментаторы соединяют параллельно на один головной ферментатор и далее ферментацию осуществляют в непрерывном режиме в две стадии в батарее параллельно соединенных ферментаторов. На первой стадии из головного ферментатора делают отъем культуральной жидкости в количестве 30% рабочего объема ферментатора за сутки в сборник ферментированных растворов, затем поочередно из остальных ферментаторов делают отъемы культуральной жидкости в количестве 10% рабочего объема в головной ферментатор. Объем культуральной жидкости в остальных ферментаторах восполняют доливом такого же объема стерильной воды. Затем проводят доливы мелассного раствора с концентрацией сахара 180 г/дм³ со скоростью подачи 50 мл/ч, поддерживая концентрацию органических кислот в культуральной жидкости 80-90 г/дм³, концентрацию сахара 10-12 г/дм³. Через каждые 24 часа вводят NH₄Cl и KCl.

На второй стадии в головном ферментаторе происходит утилизация остаточного сахара до концентрации 3-5 г/дм³ и нарастание органических кислот до 110-130 г/дм³. После чего из него вновь делают отъем культуральной жидкости в количестве 30% рабочего объема за сутки в сборник ферментированных растворов. Через каждые 24 часа вводят KCl. Количество воздушно-сухой биомассы в ферментаторах на каждой стадии поддерживают в пределах 12-16 г/дм³, вязкость 0,04-0,05 Па·с. Далее процесс повторяют и осуществляют до снижения активности гриба продуцента и невоспроизводимости достигнутых показателей, и тогда дальнейшее ведение процесса нецелесообразно. По данной схеме длительность процесса составила 30 суток. По окончании ферментации культуральную жидкость из всех ферментаторов батареи инактивируют, направляют в сборник, затем отделяют от биомассы гриба фильтрованием, лимонную кислоту выделяют обычным способом, например осаждением в виде цитрата кальция.

Результаты приведены в таблице, из которой видно, что концентрация органических кислот составляет 116,2 г/дм³; массовая доля лимонной кислоты - 93,7%; выход лимонной кислоты от сахара - 88,4%.

Пример 2. В качестве сырья используют сахар-песок. Стерильную питательную среду, содержащую: сахарозу - 50,0 г/дм³, NH₄NO₃ - 2,5 г/дм³, КН₂PO₄ - 0,16 г/дм³, MgSO₄·7Н₂O - 0,25 г/дм³, мелассу - 17,0 г/дм³, засевают спорами гриба Aspergillus niger штамм ВКПМ F-719. Подращивание осуществляют аналогично примеру 1 в течение 36 часов. Ферментацию проводят в 4-х ферментаторах емкостью 30 дм³ на питательной среде следующего состава: сахароза - 150,0 г/дм³; NH₄NO₃ - 2,5 г/дм³; КН₂PO₄ - 0,16 г/дм³; ZnSO₄·7H₂O - 0,005 г/дм³; MgSO₄·7H₂O - 0,25 г/дм³.

Ферментацию проводят аналогично примеру 1, исключая доливы в ферментаторы питательного раствора с концентрацией сахара 180 г/дм³ в ходе процесса в периодическом режиме, а также изменяя состав вводимых солей в непрерывном режиме. Через каждые 24 часа в головной ферментатор вводят KCl, MnSO₄·5Н₂О и MgSO₄·7Н₂О, в остальные ферментаторы вводят NH₄Cl, (NH₄)₂HPO₄, MnSO₄·5Н₂О, MgSO₄·7Н₂О, KCl. Длительность процесса составила 25 суток. Результаты представлены в таблице, из которой видно, что концентрация органических кислот составляет 123,7 г/дм³; массовая доля лимонной кислоты - 98,2%; выход лимонной кислоты от сахара - 93,6%.

Пример 3.

В качестве сырья используют сахар - сырец. Посевной материал для ферментации получают по примеру 2. В качестве продуцента лимонной кислоты используют штамм гриба Aspergillus niger ВКПМ F-501. Ферментацию проводят в периодическом и непрерывном режимах по примеру 2, за исключением режима введения солей в ходе ферментации в непрерывном режиме. Соли вводят через каждые 48 часов. Длительность процесса 27 суток.

Результаты представлены в таблице, из которой видно, что: концентрация органических кислот составляет 129,6 г/дм³; массовая доля лимонной кислоты - 96,6%; выход лимонной кислоты от сахара - 95,5%.

При непрерывном культивировании по известному способу продолжительность процесса составила 23 дня, массовая доля лимонной кислоты - 93,1%.

Предлагаемый способ получения лимонной кислоты позволяет повысить выход лимонной кислоты до 95,5% за счет увеличения производительности батареи ферментаторов и обеспечения стабилизации параметров процесса на максимально высоком уровне и увеличить длительность процесса биосинтеза лимонной кислоты до 30 суток и более.

Таблица.
Показатели процесса непрерывной ферментации углеводсодержащего сырья в лимонную кислоту по предлагаемому способу в сравнении с известнымПримерСырьеШтаммДлительность ферментации, сутМассовая концентрация сахара в питательной среде, г/дм³Концентрация органических кислот, г/дм³Массовая доля лимонной кислоты, %Масса лимонной кислоты с 1 аппарата, гВыход лимонной кислоты от сахаров, %1мелассаВКПМ F-1713030,0116,293,74620,888,42сахар-песокВКПМ F-71925150,0123,798,25331,193,63сахар-сырецВКПМ F-50127150,0129,696,66530,495,5по прототипусахар288/95120,0---73,8меласса288/9540,0---88,6

Изобретение относится к микробиологической промышленности. Лимонную кислоту получают путем ферментации гриба Aspergillus niger. Процесс ферментации проводят в периодическом режиме в ферментаторах, в количестве не менее 3-х, один из которых головной, до достижения в головном ферментаторе концентрации органических кислот в пределах 110-130 г/дм³ и сахара 3-5 г/дм³. В остальных ферментаторах 80-90 г/дм³ и 10-12 г/дм³ соответственно. Процесс ферментации в непрерывном режиме осуществляют в 2 стадии в батарее ферментаторов, соединенных параллельно с головным. При этом поддерживают концентрации органических кислот и сахара, достигнутые до перевода в непрерывный режим, воздушно-сухой биомассы в пределах 12-16 г/дм³ и вязкость в пределах 0,04-0,05 Па·с. Для этого проводят периодические отъемы культуральной жидкости с концентрацией сахара 3-5 г/дм³ из головного ферментатора, а из остальных ферментаторов с концентрацией сахара 10-12 г/дм³ в головной, с доливом в них питательного раствора и стерильной воды. Дополнительно вводят источники углеводов и минеральных солей. Изобретение позволяет повысить выход лимонной кислоты за счет повышения производительности батареи, стабилизации параметров процесса биосинтеза на одном уровне в каждом ферментаторе и увеличения длительности процесса ферментации. 1 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Способ получения лимонной кислоты, включающий непрерывную постадийную ферментацию гриба Aspergillus niger на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли в батарее ферментаторов, поддерживая на каждой стадии условия, необходимые для роста гриба и кислотообразования, путем подачи необходимого количества питательной среды, отличающийся тем, что сначала проводят процесс ферментации в периодическом режиме в ферментаторах, в количестве не менее 3, один из которых головной, до достижения в головном ферментаторе концентрации органических кислот в пределах 110-130 г/дм³ и концентрации сахара 3-5 г/дм³, а в остальных ферментаторах 80-90 г/дм³ и 10-12 г/дм³ соответственно, а процесс непрерывной ферментации осуществляют в две стадии в батарее ферментаторов, соединенных параллельно с головным ферментатором, причем на каждой стадии поддерживают концентрацию органических кислот и концентрацию сахара в культуральной жидкости, достигнутые до перевода процесса ферментации в непрерывный режим, вязкость культуральной жидкости в пределах 0,04-0,05 Па·с и воздушно-сухую биомассу в пределах 12-16 г/дм³ путем периодических отъемов культуральной жидкости с концентрацией сахара 3-5 г/дм³ из головного ферментатора в сборник и из остальных ферментаторов с концентрацией сахара 10-12 г/дм³ в головной с последующим доливом в них питательного раствора и стерильной воды.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в ходе процесса непрерывной ферментации дополнительно вводят источники углеводов и минеральных солей.