ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ MUS MUSCULUS L - ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К 146S-КОМПОНЕНТУ ВИРУСА ЯЩУРА АЗИЯ-1 Российский патент 1994 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к гибридомной технонологии, а именно к гибридомной тенологии, и представляет собой новый штамм гибридных клеток, продуцирующих в клеточных культурах и асцитических жидкостях монолоклональные антитела (МАт) к вирусу ящура Азия-1, используемые в вирусологии и иммунологии для научных исследований и для получения диагностических, лечебных и профилактических препаратов против вируса ящура. Применение противоящурных МАт позволяет усовершенствовать и стандартизовать методы диагностики ящура сельскохозяйственных животных. При этом МАт позволяют не только типировать ящур, но идентифицировать вариантную и штаммовую специфичность его возбудителя. Кроме того, МАт могут применяться для очистки вирусных препаратов, при определении антигенной структуры возбудителя путем создания диагностических панелей антител, а также для определения противоящурных антител в сыворотке крови животных с целью изучения противоящурного иммунитета.

В настоящее время в ветеринарной практике для идентификации вируса ящура обычно применяют поликлональные антитела, полученные от больных, переболевших или иммунизрованных соответствующим антигеном восприимчивых животных. Такие антитела обладают рядом недостатков: 1) высокая гетерогенность сывороточных иммуноглобулинов, 2) неполная воспроизводимость сывороточных препаратов, получаемых при иммунизации лабораторных животных, 3) ограниченная возможность производства специфических антител, 4) трудоемкость и дороговизна содержания животных для приготовления сывороток, 5) сложность пирготовления антигенов, особенно антигенов патогенных вирусов для иммуниизаци животных.

МАт имеют ряд приемуществ перед поликлональными антисывороткам. Они характеризуются гомогенностью, строго определенной антигенной специфичностью, аффинностью, их можно получать практически в неограниченном количестве вне организма.

Моноклональные антитела - это наиболее эффективный инструмент для изучения закономерностей взаимодействия вириуса клетки, выявления топологических, функциональных характеристик и биологических свойств возбудителя. С помощью моноклональных антител может быть изучено антигенное родство штаммов вируса ящура, в результате чего становится возможным прогнозирование защитных свойств вакцины, приготовленной из полевых изолятов.

Наиболее близким к заявляемому штамму гибридных клеток, продуцирующему моноклональные антитела к вирусу ящура Азия-1 (штамм N 48) является Азия-1 (вакцинный штамм 63/72).

Вutchainh G. и Rао В. U. (1) получили МАт на 146S компонент вируса ящура Азия-1 вакционный штамм 63/72. Изучены различные схемы иммунизации доноров спленоцитов (мышей ВАLВ/с), проведена гибридизация иммунных клеток селезенки с мышиной миеломой линии Sр 2/0. Из шести полученных гибридных клона четыре взаимодействовали только с гомологичным вирусом, два остальных перекрестно реагировали с вирусным штаммом типа С. Три из четырех МАт обладали вируснейтрализующей активностью. Нейтрализующие МАт положительно реагировали в иммуноблоттинге с изолированным белком УР₁ вирусного штамма, используемого для иммунизации.

Получение гибридом, секретирующих антитела к мелким вирусам, таким как вирус ящура, труднее, чем получение гибридом, секретирующих антитела к крупным вирусам.

МАт, продуцируемые гибридными клетками, способствуют повшыению специфичности диагностических реагентов при дифференциации вирусных изолятов и молекулярно-биологической характеристике вируса.

Целью изобретения является получение штамма гибридных клеток (гибридомы), продуцирующих МАт к вирусу Азия-1 (штамм N 48), высоко активных в ИФА, РН и РЗ в отношении гомологического вируса и не активных с гетерологичными антигенами (А₂₂, О₁ и С₁, Сат-3 и др. ). В СССР вирус ящура Азия-1 (штамм N 48) является производственным при изготовлении диагностических препаратов и вакцин.

Цель достигнута получением нового штамма гибридных культивируемых клеток животных Мus musculus L. ВСКК (II) 517D, продуцирующего моноклональные антитела к 146 S компоненту вируса ящура Азия-1 (штамм N 48).

Предлагаемое решение соответствует критерию изобретения "новизна", так как предложенный штамм клеток получен впервые и сведения о нем в открытой печати не публиковались.

Предлагаемое решение соответствует критерию изобретения "существенные отличия", так как предложенный штамм клеток является новым и при его использовании достигается положительный эффект, указанный в цели изобретения.

Предлагаемое решение соответствует критерию изобретения "положительный эффект".

Моноклональные антитела, полученные от штамма гибридных культивируемых клеток ВСКК (II) 517D, гомогенны. Титр этих антител постоянен, специфичность высокая. Гибридные клетки можно выращивать в желаемых объемах.

МАт к вирусу Азия-1 имеют высокую специфическую активность с гомологичным вирусом в ИФА, РН и РЗ на мышатах-сосунах.

Предлагаемый штамм под авторским наименованием N 11 А₄-90 (GF Аsiа-1-90/11) хранится в музее клеточных культур ВНИЯИ и депонирован во Всесоюзной коллекции клеточных культур (г. Ленинград) под регистрационным N ВСКК (II) 517 D.

Штамм гибридных клеток (гибридома) получен по разработанной методике получения и поддержания гибридных клеток, секретирующих моноклональные антитела к вирусу ящура.

Мышам линии ВАLВ/с в возрасте 1,5-2 мес вводили 146S компонент вируса Азия-1 (штамм N 48) в количестве 100 мкг/мышь интраперитонеально в соотношении 1: 1 с полным адъювантом Фрейнда. Через 21 день проводили гипериммунизацию мышей интраперитонеально без адъюванта этим же антигеном в дозе 100 мкг/мышь.

Спустя 3 дня после повторного введения антигена проводили тестирование сыворотки мышей в ИФА на наличие специфических антител. В опыт отбирали доноров с титром антител в сыворотке крови не менее 10³.

Для гибридизации у иммунизированных мышей стерильно брали селезенку и ресуспендировали в 50 мл культуральной среды ДМЕМ без сыворотки. Клетки миеломы линии РАI в логарифмической фазе роста омывали в среде ДМЕМ без сыворотки, смешивали с иммуными клетками селезнки в сотношении 1: 5 и осаждали центрифугированием при 1000 об/мин 10 мин. К осадку по каплям в течение минуты добавляли 50% -ный раствор полиэтиленгликоля (ПЭГ) с м. м. 4000, содержащий 5% диметилсульфоксида (ДМСО) Клетки оставляли на три минуты с ПЭГом. Затем добавляли 5 мл среды ДМЕМ без сыворотки и оставляли на контакт на три минуты. Полученную суспензию клеток разбавляли средой ДМЕМ, содержащей 20% фетальной сыворотки и ГАТ (гипоксантин-аминоптерин-тимидин в количестве 13,6, 0,176 и 3,78 мг/л соответственно) в рабочих концентрациях. Клетки вносили в 96-24-луночные пластины фирмы "Flow Laboratories" (Великобритания) по 0,2-1,0 мл с концентрацией 100-20 тыс/лунка соответственно. Через 10 дней супернатанты гибридных клонов тестировали на наличие антител в ИФА. Позитивные клоны составляли 1-3% от общего количества клеток. Эти клоны дважды субклонировали методом предельных разведений. Стабильный клон с наивысшим титром антител обозначили N 11 А₄-90 (GF Аsia-1-90/11) и депонировали во Всесоюзной коллекции клеточных культур (г. Ленинграда) под регистрационным N ВСКК (II) 517D.

Полученный штамм имеет следующие морфологические и культуральные признаки.

Морфологические признаки. Клетки круглые, различной величины. Ядра занимают большую часть клетки.

Кариология культуры. Кариотип соответствует виду (мышиный). Модальный класс 81 хромосома-16% , модальный класс родительской миеломной линии РАI-64 хромосомы.

Культуральные признаки. Штамм растет на средах для культур млекопитающих IМДМ, ДМЕМ, RРМI-1640 с добавлением 10-20% эмбриональной бычьей сывороки с 50 мкг/мл гентамицина. При селекции гибридных клеток добавляют аминоптерин 0,176 мг/л, гипоксантин 13,6 мг/л, тимидин 3,78 мг/л (ГАТ). Оптимальная ростовая концентрация клеток 150000 кл/мл. Оптимальная рН среды 7,0-7,2, клетки инкубируют во влажной атмосфере с 5% СО₂ при 37^оС. При посеве единичные клетки в процессе размножения образуют колонии округлой формы с ровными краями, затем колонии сливаются и формируют сплошной монослой.

При посевной дозе 150 тыс. кл/мл сплошной монослой формируется на 2-3 день. Клетки обладают хорошей адгезивной способностью. Легко снимаются со стенок посуды встряхиванием без применения трипсина или версена. Жизнеспособность клеток поддерживают путем регулярных пересевов на свежую питательную среду. Частота пересева 3 раза в неделю. Кратность рассева 1: 2-1: 5. Тип роста - стационарная суспензия. При введении гидридом внурибрюшинно мышам линии ВАLВ/с образуеся асцитная или твердая опухоли. Перед введением клеток за 5-20 дней этим животным вводят внутрибрюшинно по 0,3-0,5 мл ангарского масла (ТУ 38-101-84-81). Титр антител в асцитической жидкости в ИФА составляет 10^-3-10^-5. От одной мыши получают 3-4 мл асцита. Асцит образуется через 14-20 дней.

Консервация клеток. Гибридома заморожена на 20-25 пассажах по 4-10 млн клеток в ампуле (объем 1,0-1,5 мл) в криозащитной среде, содержащей 50% культуральной среды, 43% эмбриональной сыворотки и 7% ДМСО. Клетки в криозащитной среде замораживают на программном замораживателе и хранят при -196^оС в жидком азоте. Оттаивание быстрое на водяной бане при температуре 38^оС.

Количество жизнеспособных клеток после размораживания 70-90% . Как только среда станет жидкой, клетки переносят в конический пластиковый стакан с 50 мл холодной питательной среды и осаждают центрифугированием при 1000 об/мин. Осадок ресуспендируют в 5 мл среды ДМЕМ с 20% фетальной сыворотки и ГАТ и высевают в стеклянный матрас объемом 50 см³. Клетки инкубируют при 37^оС. Когда колонии клеток заполняют 50-70% площади матраса, отбирают пробу культуральной жидкости для определения титра антител к вирусу ящура с помощью ИФА. Наивысший титр антител отмечен при полном монослое.

Культуральную жидкость можно применять в качестве диагностического препарата, однако для получения более высокого титра антител до 105 гибридные клетки в дозе 1-10 млн/0,5 мл вводят внутрибрюшинно мышам ВАlВ/с, праймированным внутрибрюшинно ангарским маслом.

Через 14-20 дней после появления у мышей асцитных или твердых опухолей собирают жидкость (3-4 мл), клетки осаждают центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 мин. Надосадочная жидкость содержит МАт.

Осадок, содержащий гибридные клетки, переводят в культуру или вводят вновь мышам. Для повышения специфичности МАт проводят их очистку и выделяют чистые иммуноглобулины. Иммуноглобулиновую фракцию получают путем двукратного осаждения 10% ПЭГа м. м. 6000 (к антителам добавляют равный объем 20% -ного ПЭГ) и центрифугируют при 3500 об/мин в течение 30 мин. Осадок ресуспендируют в уменьшенном количестве фосфатно-буферного раствора. Раствор диализируют против фосфатного буфера 24 ч при 4^оС.

Культуральная жидкость содержит 10-20 мкг/мл, а асциты 20-30 мг/мл специфических иммуноглобулинов.

Сведения о контаминантах линии. Микробиологическим, цитохимическим (окраска оливомицином, акридиновым оранжевым) и электронно-микроскопическим методами бактерии, грибы и микоплазмы не обнаружены.

П р и м е р. Ящурный антиген Азия-1 (штамм N 48) идентифицируют в ИФА с помощью моноклональных антител.

Для этого МАт, разведенные в 0,2-молярном карбонатно-бикарбонатном буфере рН 9,5, в количестве 200 мкл на лунку в концентрации 1-10 нг/мл вносят в лунки пластин из полистирола для серологических реакций и инкубируют 2-14 ч при 20-4^оС. Раствор антител удаляют и 3-5 раз промывают лунки фосфатно-буферным раствором (ФБР). Затем в лунки вносят по 200 мкл испытуемого раствора в ФБР с 10% эмбриональной сыворотки (антиген готовят путем десятикратных разведений в этом же растворе). Лунки с антигеном и антителами инкубируют 2 ч при 37^оС и 3-5 раз отмывают в ФРБ. Затем в лунки вносят конъюгат (моноклональные антитела, меченные пероксидазой хрена) в рабочем разведении. Конъюгат разводят на ФБР с 10% эмбриональной бычьей сыворотки до концентрации 1-5 мкг/мл в расчете на IgG и инкубируют 1-2 ч при комнатной температуре. Затем лунки 3-5 раз промывают ФБР и в них вносят субстрат, содержащий ортофенилендиамин 0,4 мг. мл в 0,1 М цитрат-фосфатном буфере рН 5,0 и 0, 01% Н₂О₂. После инкубации при комнатной температуре в течение 1-5 мин проводят учет реакции путем определения оптической плотности раствора на автоматическом 8-канальном фотометре Тutertek Мultiscan фирмы "Flow Laboratories" (Великобритания). Реакцию можно учитывать и визуально по интенсивности окраски коричневого цвета.

Установлено, что штамм гибридных клеток стабилен как по культуральным и морфологическим признакам, так и по титру специфических антител в ИФА, РН и РЗ.

Активность и специфичность МАт определяли в ИФА, РН, РЗ и РСК и гомо- и гетерологичными штаммами вируса ящура.

Из приведенных данных видно, что испытуемые МАт и ИФА, обладают высокой специфической активностью к гомологичному (АЗия-1) антигену и не активны в отношении вирусов А₂₂, А₅, А₁₂, О₁ N 1618, О₁К, О₂, С₁ N 564, С _65/67, Сат-3). Аналогичные результаты получены в РН. МАт к вирусу Азия-1 обладают слабой комплементсвязывающей активностью в РСК (обнаруживаются только в цельном, неразведенном материале).

Данные определения специфической активности асцитической жидкости, содержащей МАт, полученные от штамма N 11 А₄ 90 (GF Аsia-1-90/11) регистрационный N ВСКК (II) 517D, представлены в таблице.

В связи с вышеизложенным МАт могут применяться для обнаружения в ИФА, РН и РЗ антигенов вируса ящура, противоящурных антител в сыворотке крови восприимчивых сельскохозяйственных животных, а также при молекулярно-биологической характеристике возбудителя.

Противоящурные моноклональные антитела могут быть весьма полезны в ветеринарной вирусологии при:
- усовершенствовании диагностики заболевания,
- изучении его эпизоотологии,
- иммунизации и терапии животных,
- изучении тонких механизмов взаимодействия вируса и клетки,
- контроле технологии изготовления вакцин,
- выделении, очистке и изучении оптической структуры вируса.

Применение МАт в ветеринарной практике при диагностике, профилактике и лечении сельскохозяйственных животных позволит оптимизировать эпизоотическую ситуацию по ящуру в стране.

Моноклональные антитела к 146S компоненту вируса ящура Азия-1 (штамм N 48) в СССР и за рубежом в продаже отсутствуют.

Использование: вирусология, иммунология, биотехнология. Сущность изобретения: гибридома получена путем слияния клеток миеломы мыши линии PAJ с клетками селезенки мыши линии BALB/C, предварительно иммунизированной 146S компонентом вируса ящура (ВЯ) Азия-1 (штамм N 48). На средах для клеточных культур млекопитающих (ДМЕМ, IМДМ) при 37С гибридома выделяет в культуральную жидкость моноклональные антитела (МАт) к (ВЯ) Азия-1 (штамм N 48). В культуральной среде титр антител, определяемый в непрямом ИФА, равен 10^-2-10^-3 . Введенная в брюшную полость мышей линии BALB/C гибридома индуцирует образование асцитической жидкости, содеражщей МАт с титром в ИФА 10^-3-10^-5 , в РН , РЗ . Штамм обозначен N11A₄-90 (GFAsia - 1 - 90)11 и депонирован под номером ВСКК(П) N 517 Д. 1 табл.

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L. ВСКК(П) N 517Д - продуцент моноклональных антител к 146S-компоненту вируса ящура Азия-1.