Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L., продуцирующий моноклональные антитела к 146 S-компоненту вируса ящура А @ (Алье) Советский патент 1992 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности гибридомной технологии, и представляет собой новый штамм гибридных клеток, продуцирующих в клеточных культурах и асцитических жидкостях моно- клональные антитела (МАт) к вирусу ящура Аб(Алье), используемые в вирусологии и иммунологии для научных исследований и для получения диагностических лечебных и профилактических препаратов против ящура.

Наиболее близкими к предлагаемому являются штаммы гибридных культивируемых клеток Musmusculus L, продуцирующие МАт к вирусу ящура As-вакцина, As Парма, As Вестервальд (AsW) и As Испания-86

МАт к 146S компоненту вируса ящура А.5гвакцина изучены в ИФА РИА и реакции

нетрализации (РН) на культуре клеток и мышах. Установлено, что МАт, идентифицированные в ИФА и РИА, не активны в РСК, однако некоторые из них обладали вирус- нейтрализующими свойствами. В ИФА МАт активны в отношении гомологичного вируса и не реагировали с гетерологичными (От и Ci) антигенами. Полученные МАт полезны в изучении серологического родства среди различных штаммов вируса при эпизоотоло- гических исследованиях и для контроля качества реагентов в производстве вакцины

Изучение МАт к вирусу ящура As Парма проводили в конкурентном анализе со 146S и 12 S частицами. Кроме того,. 146S антиген был обработан трипсином и хемотрипси- ном.

VI

сл го

о

о

Работая с МАт, полученными на вирус AsW, установлен широкий спектр специфичности антител в отношении вариантов вируса типа А, но они отличались активностью в зависимости от штамма МАт к вирусу AgW в РН были неактивны в отношении вируса Ot и С, но нейтрализовали изоляты, содержащие антиген As(3).

Изучены свойства МАт, полученные на 146S антиген вируса ящура As Испания-86 в иммунохимических и серологических реакциях. МАт высокоактивны и специфичны в РИА и неактивны в РН.

Проведенные исследования позволили разделить полученные МАт на 5 групп, кото- рые по разному реагировали с компонентами вируса ящура, в том числе и после обработки ферментами

МАт, обладающие различным спектром характеристик, могут быть использованы для составления панели антител Однако МАт, полученные на вирус Ад Пзрма, AsW, As Испания-86, не являются идентичными антителам, полученным на As (Алье), и отличаются по активности в иммунологических реакциях РН и реакции защиты (РЗ)

Вирус ящура As (Алье) является производственным при изготовлении диагностических препаратов и вакцин в странах Восточной Европы. МАт к 146S компоненту вируса ящура As (Алье) в СССР и за рубежом в продаже отсутствуют.

Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных Musmusculus L , продуцирующе- го МАт к 146S компоненту вируса As (Алье), высоко активных в ИФА и РН, обладающих высокой специфической активностью в ИФА и РН в отношении As (Алье) и А и не активных с гетерологичными штаммами ви- руса ящура А22, Ai2, Аю, Оч, d. Азия-1

Поставленная цель достигнута получением нового штамма гибридных культивируемых клеток животных Musmusculus L, ВСКК (П) 476Д, продуцирующего монокло- нальные антитела к 1465 компоненту вируса ящура As (Алье).

Моноклон льные антитела, полученные из предлагаемого штамма гомогейны Титр этих антител постоянен, специфичность вы- сокая. Гибридные клетки можно выращивать в желаемых объемах.

Полученные МАт против вируса ящура As (Алье) реагировали в ИФА со 146S анти- геном вируса As (Алье) и А, что говорит о его высоком антигенном родстве и высокой специфичности. Аналогичные результаты получены в РН и РЗ на мышатах-сосунах

Предлагаемый штамм под авторским наименованием № 7 ГПЯ А-5-89 депонирован во Всесоюзной коллекции клеточных культур (г. Ленинград) под регистрацион ным № ВСКК(П)476Д.

Предлагаемый штамм получен следую щим образом

Мышам линии BALB/C в возрасте 1,5 2 мес вводили 146S компонент культураль- ного вируса ящура As (Алье) в количестве 100 мкг/мышь интраперитонеально в соотношении 1:1 с полным адъювантом Фрейн- да Через 21 день проводили гипериммунизацию мышей интраперитонеально без адьюванта этим же антигеном в дозе 100 мкг/мышь

Спустя 3 дня после повторного введения антигена проводили тестирование сыворотки мышей в ИФА на наличие специфических антител, В опыт отбирали доноров с титром антител в сыворотке крови не менее 103

Для гибридизации у иммунизированных мышей стерильно брали селезенку и ресуспендировали в 50 мл культуральной среды ДМ ЕМ без сыворотки Клетки миело- мы линии PAI в логарифмической фазе роста отмывали в среде ДМЕМ без сыворотки смешивали с иммунными клетками селезенки в соотношении 1 1 и осаждали центрифугированием при 1000 об/мин, К осадку по каплям в течение минуты добавляли 50%- ный раствор полиэтиленгликоля (ПЭГ) с мол м 4000, содержащий 5% диметилсуль- фоксида (ДМЗО). Клетки оставляли на 3 мин с ПЭГом. Затем добавляли 5 мл среды ДМЕМ без сыворотки и оставляли на контакт на 3 мин Полученную суспензию клеток разбавляли средой ДМЕМ содержащей 20% фетальной сыворотки и гипоксантин- аминоптерин-тимидин (ГАТ) в количестве 13,6 мг/л, 0,176 мг/л и 3,78 мг/л соответственно в рабочих концентрациях Клетки вносили в 96- и 24-луночные пластины фирмы Flow Laboratories (Великобритания) по 0,2-1 в количестве 100-20 тыс/лунка соответственно. Через 10 дней супернатанты гибридных клонов тестировали на наличие антител в ИФА. Позитивные клоны составляли 5-7% от общего количества гибридных клеток, Эти клоны дважды субклонировали методом лимитирующих разведений Отобранный стабильный клон с наивысшим титром антител обозначали № 7 ГПЯА5-89 и депонировали во Всесоюзной коллекции клеточных культур (г, Ленинград) под реги страционным № ВСКК(П) 476Д

Полученный штамм имеет следующие морфологические и культуральные призна ки

Морфологические признаки

Клетки круглые, различной величины, Ядра занимают большую часть клетки,

Кариология культуры.

Кариотип соответствует виду (мышиный). Модальный класс 84 (16%), 86 (10%). 88 (16%) хромосом. Модальный класс для родительской миеломной линии PAI-64 хромосомы.

Культуральные признаки

Штамм растет на средах для культур млекопитающих 1МДМ, ДМЕМ, RPMH640 с добавлением 10-20% эмбриональной бычьей сыворотки и 50 мкг/мл гентамици- на. При селекции гибридных клеток добавляют аминоптерин 0,176 мг/л, гипоксантин 13,6 мг/л, тимидин 3,78 мг/л. Оптимальная ростовая концентрация клеток 150000 кл/мл, Оптимальная рН среды 6,8-7,4, клетки инкубируют во влажной атмосфере с 5% С02 при 37°С, При посеве единичные клетки в процессе размножения образуют колонии округлой формы с ровными краями, затем колонии сливаются и формируют сплошной монослой,

При посевной дозе 150 тыс кл/мл сплошной монослой формируется на 2-3-й день. Клетки обладают хорошей адгезивной способностью, легко снимаются со стенок посуды встряхиванием без применения трипсина или версена. Жизнеспособность клеток поддерживают путем регулярных пересевов на свежую питательную среду. Частота пересева 2-3 раза в неделю. Кратность рассева 1Ф2 1.5 Тип роста -стационарная суспензия При введении гибридом внутрибрюшинно мышам линии BALB/C образуется асцитна я или твердая опухоли. Перед введением клеток за 5-20 дней этим животным вводят внутрибрюшинно по 0,5 мл ангарского масла (ТУ 38- 101-84-81). Титр антител в асцитичегской жидкости в ИФА составляет 10 -10J, От одной мыши получают 3-4 мл асцита. Асцит образуется через 14-20 дней

Консервация клеток.

Гибридома заморожена на 20-25 пассажах по 4-10 млн клеток в ампуле (объем 1,0-1,5 мл) в криозащитной среде, содержащей 50% культуральной среды, 43% эмбриональной сыворотки и 7% ДМСО. Клетки в криозащитной среде замораживают на программном замораживателе и хранят при - 196°С в жидком азоте. Оттаипоиие быстрое на водяной бане при 38°С

Количество жизнеспособных клеток после размораживания 60-90% Как только среда станет жидкой, клетки переносят в конический пластиковый стакан с 50 мл холодной питательной среды и осаждяют центрифугированием при 1000 об/мин Осадок

ресуспендируот в 5 мл среды ДМЕМ с 20% фетэльной сыворотки и ГАТ и высевают на стеклянный матрас объемом 50 см3. Клетки инкубируют при 37°С. Когда колонии клеток 5 заполняют 50-70% площади матраса, отбирают пробу культуральной жидкости для определения титра антител к вирусу ящура с помощью ИФА. Наивысший титр антител отмечен при полном монослое.

0 Культуральную жидкость можно применять в качестве диагностического препарата, однако для получения более высокого титра антител до 10 гибридные клетки в дозе 1-10 мин/0,5 мл вводят внутрибрю5 шинно мышам BALB/C, праймированным внутрибрющинно ангарским маслом.

Через 14-30 дней после появления у мышей асцитных или твердых опухолей собирают жидкость (3-4 мл), клетки осаждают

0 центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 мин. Надосадочная жидкость содержит МАт.

Осадок, содержащий гибридные клетки, переводят в культуру или вновь вводят мы5 шам. Для повышения специфичности МАт проводят их очистку и выделяют чистые иммуноглобулины. Иммуноглобулиновую фракцию получают путем двукратного осаждения 10% ПЭГ (а) м,м. 6000 (к антителам

0 добавляют равный объем 20%-ного ПЭГ) и центрифугируют при 3500 об/мин в течение 30 мин. Осадок ресуспендируют в уменьшенном количестве фосфатно-буферного раствора (ФБР). Раствор диализируют про5 тив ФБР 24 ч при 4°С. Культуральная жидкость содержит 10-20 мкг/мл, а асциты - 20-30 мг/мл специфических иммуноглобулинов,

Сведения о контаминантах линии. Бак0 терии не обнаружены, грибы не обнаружены, микоплазмы не обнаружены.

Пример. Ящурный антиген As (Алье) идентифицируют в ИФА с помощью МАт. Для этого МАт, разведенные в 0,02-моляр5 ном карбонатно-бикарбонатном буфере рН 9,5, в количестве 200 мкл на лунку в концентрации 3-100 нг/мл вносят в лунку пластин из полистирола для серологических реакций и инкубируют 2-14 ч при температуре 200 4°С. Раствор антител удаляют и 3-5 раз промывают лунки ФБР. Затем влунки вносят по 200 мкл испытуемого раствора в ФБР с 10% эмбриональной сыворотки (антиген готовят путем десятикратных разведений в этом же

5 растворе): Лунки с антигеном и антителами .инкубируют 2 ч при 37°С и 3-5 раз отмывают в ФБР. Затем в лунки вносят конъюгат (мо- ноклональные антитела, меченые перокси- дазой хрена) в рабочем разведении Конъюгат разводят на ФБР с 10% эмбриональной бычьей сыворотки до концентрации 1-5 мкг/мл в расчете на IgC и инкубируют 1-2 ч при комнатной температуре. Затем лунки 345 раз промывают ФБР и в них вносят субстрат, содержащий ортофенилендиа- мин 0,4 мг/мл в 0,1 М цитрат-фосфатном буфере, рН 5,0 и 0,01 % Н202. После инкубации при комнатной температуре в течение 1-5 мин проводят учет реакции путем определения оптической плотности раствора на автоматическом 8-канальном фотометре Fltertebe Multlscan фирмы F ow Laboratories (Великобритания). Реакцию можно наблюдать и визуально по интенсивности окраски коричневого цвета.

Установлено, что штамм гибридных клеток стабилен как по культурэльным и морфологическим признакам, так и по титру специфических антител в ИФА, РН и РЗ

Активность и специфичность МАт определяли в ИФА, РН, РЗ, РСК и РДСК с гомо- и гетерологичными штаммами вируса ящура.

Данные определения специфической активности асцитической жидкости, содержащей МАт, полученные от штамма № ВСКК(П)476Д, представлены в таблице

Из приведенных данных видно, что испытуемые МАт в ИФА обладают высокой специфической активностью к гомологичному (As) и близкородственному (Ау) антигену и совсем не активны в отношении вирусов

А22, Oi № 194, Ci № 564 и Азия-1. Аналогичные результаты получены в РН. МАт к вирусу As не обладают комплементсвязывающей активностью в РСК и РДСК.

Полученные МАт могут применяться для

обнаружения антигенов вируса ящура в ИФА, РН, РЗ, а также для изучения их антигенной структуры.

Формула изобретения Штамм гибридных культивируемых клеток животных Musmusculus L. ВСКК(П) 476Д, продуцирующий моноклональные антитела к 1465-компоненту ящура As (Алье)

Использование биотехнология, вирусология, иммунология Сущность изобретения: штамм получен путем слияния клеток миеломы мыши линии РА с клетками селезенки мыши линии BAIB/C, предварительно иммунизированной 146 S-компонентом культурального вируса Ав(Алье}. На средах для клеточных культур млекопитающих

н/а - неактивны.