СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТЕРАПЕВТИЧЕСКОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К КЕТОТИФЕНУ БОЛЬНЫХ С АЛЛЕРГИЧЕСКИМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ Российский патент 1997 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, а именно к аллергологии, и может быть использовано для отбора больных с аллергическими заболеваниями, такими как атопический дерматит, респираторные аллергозы, крапивница, отеки Квинке и т. д. у которых лечение кетотифеном будет заведомо эффективным.

Наиболее близким к изобретению по совокупности существенных признаков является способ определения терапевтической чувствительности к кетотифену больных с аллергическими заболеваниями (1). В способе-прототипе кетотифен назначают всем больным с подтвержденным диагнозом аллергического заболевания в фармакопейно принятых дозировках и режиме. Эффективность терапии у каждого конкретного больного оценивают по уменьшению клинических симптомов заболевания, таких как уменьшение кожного зуда у больных атопическим дерматитом, урежение приступов бронхоспазмов при респираторных аллергозах, уменьшение симптомов ринита и конъюктивита и т.д. через 3-4 недели от начала применения кетотифена. В случае наличия индивидуальной реакции больного, проявляющейся в редукции симптоматики под влиянием препарата, проводят полный курс лечения кетотифеном в течение 4-12 недель.

Способ-прототип не позволяет получить технический результат, достигаемый при использовании заявленного способа. Это обусловлено тем, что известный способ (1) представляет собой клиническую оценку результатов уже произведенного воздействия на организм больного. Несмотря на то, что максимальная концентрация кетотифена в плазме крови человека достигается уже через 2-4 ч после приема препарата (2), для развития его клинического действия необходим более длительный срок, составляющий 4-10 недель (3). Отсутствие возможности оценивать эффективность кетотифена по состоянию "маркеров" клеточного или субклеточного уровня, специфически реагирующих на воздействие рассматриваемого препарата, приводит к невозможности прогнозировать результат лечения до начала воздействия, а также к относительно большой длительности процесса определения терапевтической чувствительности каждого конкретного больного к кетотифену. Кроме того, учитывая, что клинический эффект кетотифена наблюдается лишь у 50-60% больных аллергическими заболеваниями (4), необходимость обязательного приема лекарства в течение 3-4 недель для выяснения целесообразности его использования не позволяет избежать проявления побочных эффектов у больных с отсутствием терапевтической чувствительности к препарату.

Задачей изобретения является создание способа определения терапевтической чувствительности к кетотифену больных с аллергическими заболеваниями, обеспечивающего возможность до начала лечения in vitro выявлять больных, лимфоциты которых обладают специфическими морфо-функциональными особенностями, обуславливающими совпадение клинически значимых пространственных и энергетических характеристик лимфоцита и препарата.

Решение поставленной задачи достигается тем, что в способе определения терапевтической чувствительности к кетотифену больных аллергическими заболеваниями путем исследования реакции организма на воздействие препарата, согласно изобретению перед началом терапевтического воздействия исследуют кровь больного in vitro, при этом взвесь лимфоцитов больного делят на две части, в контрольную пробу вносят растворитель, в опытную пробу вносят раствор кетотифена в конечной концентрации 100 нг/мл, инкубируют обе пробы в термостате в течение 2 ч, затем подсчитывают содержание неадгезированных (неприлипших) лимфоцитов в каждой пробе и при снижении их количества в опытной пробе на 30% и более по сравнению с контрольной определяют терапевтическую чувствительность больного к кетотифену.

Выбор оптимальной концентрации кетотифена, добавляемого к опытной пробе крови при использовании заявляемого способа, проводили путем исследования влияния различных концентраций кетотифена на точность определения терапевтической чувствительности больных к препарату, т.е. на точность прогноза.

Были исследованы две группы детей в возрасте от 4 мес до 15 лет с подтвержденным диагнозом аллергического заболевания. Диагноз был предварительно поставлен по результатам комплексного обследования больных, включающего сбор анамнеза, оценку клиники заболевания, постановку скарификационных и провокационных проб с аллергенами и т.д. Для исследования были отобраны дети, у которых в анамнезе отмечался или не отмечался положительный терапевтический эффект при лечении кетотифеном. При этом отбирали детей, у которых лечение кетотифеном было произведено не менее года назад, чтобы заведомо исключить последействие препарата (5). Обследовано две группы больных:
I группа больные аллергическими заболеваниями, у которых кетотифен оказывал хороший лечебный эффект (т.е. значительно уменьшал или ликвидировал клинические симптомы) 41 человек;
II группа больные аллергическими заболеваниями, у которых кетотифен не оказывал влияния или вызывал обострение заболевания 27 человек.

Клинический эффект кетотифена оценивали не ранее, чем через 1 мес (1) после приема препарата в фармакопейне принятых дозировках и режиме (2).

Результаты исследований представлены в табл.1.

Из данных табл. 1 видно, что именно концентрация кетотифена 100 нг/мл обеспечила наибольшую точность прогноза в группе больных с клинически подтвержденным хорошим лечебным эффектом кетотифера (I группа) при отсутствии ложноположительных результатов в группе с клиническими подтвержденным отсутствием терапевтической чувствительности к препарату (II группа).

Для выявления интервала прогностически значимых различий количества неприлипших (неадгезированных) лимфоцитов в опытной и контрольных пробах, обеспечивающих наибольшую точность определения, с использованием заявленного способа были обследованы две группы детей с подтвержденным диагнозом аллергического заболевания:
I группа больные аллергическими заболеваниями, у которых кетотифен оказывал хороший лечебный эффект 41 человек;
II группа больные аллергическими заболеваниями, у которых кетотифен не оказывал лечебного эффекта или вызывал обострение заболевания 27 человек.

Результаты представлены в табл.2.

Из данных табл.2 следует, что прогностически значимым является различие количества неприлипших лимфоцитов в опытной и контрольной пробах, равное 30% и более, т.к. при этих значениях достигается максимальное количество подтвержденных клинически положительных результатов терапевтического воздействия кетотифена (I группа) при отсутствии ложно-положительных результатов в группе с клинически подтвержденным отсутствием лечебного эффекта препарата (II группа).

Для выбора оптимального срока инкубации проб в термостате, обеспечивающего наибольшую точность прогнозирования, обследованы две группы детей с подтвержденным диагнозом аллергического заболевания:
I группа больные с аллергическими заболеваниями, у которых кетотифен оказывал хороший лечебный эффект 41 человек;
II группа больные с аллергическими заболеваниями, у которых кетотифен не оказывал лечебного эффекта или вызывал обострение заболевания 27 человек.

Результаты представлены в табл.3.

Из данных табл.3 следует, что оптимальным сроком инкубации проб в термостате является срок 2 ч, т.к. при таком сроке достигается максимальное количество подтвержденных клинически положительных результатов в I группе при отсутствии ложно-положительных результатов во II группе.

Достижение обеспечиваемого изобретением технического результата обусловлено следующим. Известно, что препарат кетотифен (задитен) (4,9-дигидро-4 (1-метил-4-пиперидинилиден-1OH-бензо [4,5] циклогепта[1,2-b] -тиофен-10-он(гидрофумарат)) применяется для лечения астмы и аллергии и обладает антигистаминным действием, осуществляющимся за счет блокады H₁-гистаминовых рецепторов, а также противовоспалительным действием, обусловленным ингибированием высвобождения биологически активных веществ из тучных клеток, таких как медленно реагирующее вещество анафилаксии и фактор, активирующий тромбоциты (2,6). При анализе патентной и научно-медицинской литературы не обнаружено сведений о наличии у кетотифена способности влиять на адгезивные свойства лимфоцитов, а также данных о взаимосвязи этого свойства препарата с терапевтической чувствительностью к нему больных с аллергическими заболеваниями.

Известно, что при воздействии причинно-значимого аллергена на лимфоциты крови больных аллергией тормозится адгезия этих клеток к пластику или стеклу (7), т.е. под влиянием аллергена в надосадочной жидкости увеличивается количество неприлипших клеток. В настоящее время механизм этого явления недостаточно ясен, поскольку имеется несколько относительно противоречивых точек зрения. Одна из теорий, объясняющих снижение адгезии лимфоцитов под влиянием аллергена, базируется на экспериментальных данных, свидетельствующих об изменении синтеза и/или экспрессии адгезивных молекул на лимфоцитах в присутствии аллергена (8). По-видимому, за счет адгезивных свойств клеток (в т.ч. лейкоцитов и лимфоцитов) и происходит генерализация аллергического воспаления, которое, как правило, не ограничивается местом действия аллергена, а захватывает большие территории, а часто и другие органы и ткани, а не только те, на которые действовал аллерген.

Используя метод подобия, можно предположить, что именно выявленной авторами изобретения способностью кетотифена увеличивать адгезивные свойства лимфоцитов и объясняется его противоаллергическое действие. Увеличивая "прилипаемость" лимфоцитов, препарат способствует локализации аллергической реакции и препятствует "диссеминации" аллергического воспаления. Однако экспериментальные исследования авторов заявленного решения показали также, что обнаруженное свойство кетотифена проявляется избирательно, причем терапевтическое действие препарат оказывает только у тех больных, у которых в его присутствии увеличивается адгезия лимфоцитов. Это можно объяснить тем, что по-видимому, лимфоциты некоторых больных аллергическими заболеваниями обладают специфическим морфо-функциональными особенностями, когда пространственная структура внешней фестончатой оболочки лимфоцита и обусловленная ею направленность сложного энергетического поля лимфоцита соответствуют пространственной конфигурации и энергетическим характеристикам кетотифена. В этом случае при воздействии препарата происходит усиление функционирования специфических активных центров такого лимфоцита, что выражается в увеличении экспрессии и/или синтеза адгезивных молекул, в связи с чем у этих больных кетотифен оказывает свой лечебный эффект. У больных, лимфоциты которых лишены этих особенностей, препарат неэффективен.

Таким образом, именно выявленная авторами предложенного способа взаимосвязь между клиническим эффектом кетотифена и его способностью увеличивать адгезивные свойства лимфоцитов, обладающих специфическими морфо-функциональными особенностями, обуславливающими совпадение их пространственных и энергетических характеристик с пространственными и энергетическими характеристиками препарата, позволяет с помощью реакции in virto определять терапевтическую чувствительность к препарату у каждого конкретного больного перед началом воздействия и отбирать больных, у которых применение рассматриваемого лекарственного средства будет заведомо эффективным. При этом из известного уровня техники не выявляется влияния предписываемых изобретением преобразований, характеризуемых отличительными от прототипа существенными признаками, на достижение технического результата.

Способ осуществляют следующим образом. У больного утром натощак берут 1 мл крови из пальца или из вены в пробирку, содержащую 0,05 мл гепарина в концентрации 200 ед/мл (конечная концентрация гепарина в крови 10 ед/мл). Пробирку встряхивают для смешивания крови с гепарином и по методике (7) на градиенте плотности фиколл-верографии выделяют лимфоциты, дважды отмывают их средой Хенкса и один раз средой 199 путем центрифугирования при 1500 об/мин. в течение 10 мин. Затем ресуспендируют лимфоциты в среде 199 до концентрации 10⁶ клеток/мл. В контрольную пробирку вносят 0,1 мл среды 199, в опытную пробирку вносят 0,1 мл раствора кетотифена на среде 199 в концентрации 200 нг/мл. В контрольную и в опытную пробирки добавляют по 0,1 мл суспензии лимфоцита (конечная концентрация кетотифена в опытной пробирке 100 нг/мл). Обе пробирки контрольную и опытную помещают в термостат при 37^oC на 2 ч. По окончании инкубации пробирки вынимают из термостата и подсчитывают количество неприлипших лимфоцитов в жидкости, содержащейся в каждой пробирке, с помощью камеры Горяева (подсчет ведут в 100 больших квадратах сетки камеры). Определяют на сколько процентов количество лимфоцитов в опытной пробе меньше, чем в контрольной по формуле:

где
Л_к количество лимфоцитов в контрольной пробе,
Л_о количество лимфоцитов в опытной пробе.

При снижении числа лимфоцитов в опытной пробе на 30% и более по сравнению с контрольной определяют терапевтическую чувствительность к кетотифену у больного с аллергическим заболеванием. Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Люба И. 8 лет, история болезни N 6784, поступила в больницу с диагнозом "Диффузный нейродермит. Пищевая аллергия на молоке и облигатные аллергены". Из анамнеза болезни известно, что девочка больна с 2-месячного возраста: после прекращения грудного вскармливания и перевода на искусственное вскармливание молочными смесями появились изменения на коже по типу детской экземы, которые к 3 годам трансформировались в нейродермит. Ухудшение состояния кожи отмечено при употреблении коровьего молока, яиц, рыбы, апельсинов, крепких бульонов, копченостей. Гипоаллергенная диета с исключением молока и облигатных аллергенов, соблюдавшаяся в течение 3 мес, предшествующих госпитализации, не привела к улучшению состояния ребенка. Ранее больная кетотифен не получала. При осмотре в день поступления в больницу больная предъявляла жалобы на выраженный кожный зуд. Состояние удовлетворительное. Правильного телосложения, достаточного питания. На коже всего тела шелушение, обилие расчесов с гемморагическими корочками, в подколенных ямках, локтевых сгибах, на шее кожа лихенизирована, имеются проявления периорального дерматита, в углах рта трещины. Слизистые, зев чистые. Границы сердца не расширены, тоны ритмичные, пульс 80 уд/мин. Перкуторно над легкими ясный легочный звук, дыхание везикулярное, хрипов нет. Живот мягкий, безболезненный, печень и селезенка не увеличены. Физиологические отправления в норме. На второй день после поступления в больницу больная обследована с помощью заявленного способа.

Утром натощак у больной из вены взяли 1 мл крови в пробирку, содержащую 0,05 мл гепарина в концентрации 200 ед/мл (конечная концентрация гепарина в крови составила 10 ед/мл). Пробирку встряхнули для смешивания крови с гепарином и по методике (7) на градиенте плотности фиколл-верографии выделили лимфоциты, дважды отмыли их средой Хенкса и один раз средой 199 путем центрифугирования при 1500 об/мин в течение 10 мин. Затем ресуспендировали лимфоциты в среде 199 до концентрации 10⁶ клеток/мл. В контрольную пробирку внесли 0,1 мл среды 199, в опытную пробирку внесли 0,1 мл раствора кетотифена на среде 199 в концентрации 200 нг/мл. В контрольную и в опытную пробирки добавили по 0,1 мл суспензии лимфоцитов (конечная концентрация кетотифена в опытной пробирке составила 100 нг/мл). Обе пробирки контрольную и опытную поместили в термостат при 37^oC на 2 ч. По окончании инкубации пробирки извлекли из термостата и подсчитали количество неприлипших лимфоцитов в каждой пробирке с помощь камеры Горяева (подсчет вели в 100 больших квадратах сетки камеры). Количество неприлипших лимфоцитов в 100 квадратах сетки Горяева в контрольной пробе составила 83, а опытной 36, т.е. в опытной пробе лимфоцитов было на меньше, чем в контрольной, что позволило определить терапевтическую чувствительность ребенка к кетотифену. Продолжительность процесса определения составила 4 ч. Девочке был назначен кетотифен по 1 таблетке (1 мг) два раза в день. Через один месяц проведена клиническая оценка действия препарата по способу-прототипу: исчез кожный зуд и проявления периорального дерматита, кожа стала гладкой и эластичной, исчезло шелушение, хотя еще сохранялись участки лихенизации в подколенных ямках и локтевых сгибах. При последующем наблюдении за ребенком в течение курса лечения (3 мес) сохранялась ремиссия заболевания, очистилась кожа в подколенных ямках и локтевых сгибах. Побочных эффектов не отмечено.

Таким образом, прогноз терапевтического эффекта кетотифена, полученный с помощью заявленного способа подтвердился при клиническом наблюдении за ребенком после назначения кетотифена.

Пример 2. Антон К. 12 лет, история болезни N 1468, поступил в больницу с диагнозом "Атопическая бронхиальная астма (бытовая сенсибилизация), среднетяжелое течение, приступный период". Из анамнеза болезни известно, что с 1,5 лет отмечаются приступы затрудненного дыхания на фоне нормальной температуры тела, которые вначале расценивались как обструктивный бронхит, а с 2,5 лет после появления типичных приступов удушья поставлен диагноз "Бронхиальная астма". Приступы возникают ежедневно, чаще ночью, купируются ингаляциями беротека. Из-за приступов ребенок просыпается каждую ночь. При обследовании при предыдущих госпитализациях выявлена сенсибилизация к домашней пыли. Раньше больной кетотифена не получал. При осмотре в день поступления состояние средней тяжести, экспиратораня одышка с участием вспомогательной мускулатуры, коробочный перкуторный звук над грудной клеткой, при аускультации рассеянные сухие хрипы в легких. Со стороны других органов патологии не выявлено. На второй день после поступления в больницу ребенок обследован с помощью заявленного способа, как указано в примере 1. Количество неприлипших лимфоцитов в контрольной пробе составило 76, а опытной 50, т.е. в опытной пробе лимфоцитов было на 34% меньше, чем в контрольной, что было основой для прогноза терапевтического эффекта кетотифена. Продолжительность процесса определения составила 4,5 ч. Больному назначен кетотифен в дозе 1 мг (1 таблетка) два раза в день (2). Уже через 3 недели при проведении обследования по способу-прототипу отмечено улучшение состояния больного: при осмотре хрипов в легких нет, исчезли ночные приступы бронхиальной астмы, ребенок спокойно спит ночью, днем приступы затрудненного дыхания стали реже (2 раза в неделю), проходят самостоятельно и не требуют назначения беротека. Курс лечения кетотифеном составил 4 мес. Отмечено полное исчезновение приступов затрудненного дыхания. Побочных эффектов препарата не наблюдалось.

Таким образом, при клинической оценке терапевтического эффекта назначенного кетотифена подтвержден прогноз, полученный с помощью заявленного способа.

С использованием заявленного способа было обследовано 119 детей в возрасте от 4 мес до 15 лет с подтвержденным диагнозом аллергического заболевания: 96 детей с атопическим дерматитом и 23 ребенка с дермато-респираторным синдромом (сочетание атопического дерматита с респираторным аллергозом). Все дети на второй день после осмотра в аллергоцентре были обследованы с помощью заявленного способа.

Для подтверждения прогноза, полученного при использовании заявленного способа, всем детям назначали кетотифен в фармакопейно принятых дозировках и режиме (2). В последующем дети наблюдались врачом в течение всего курса лечения. Эффективность терапии у каждого конкретного больного оценивали по уменьшению кожного зуда, урежению приступов бронхоспазма, уменьшению симптомов ринита и конъюктивита и т. д. через 1 мес после начала приема препарата (способ-прототип) и по окончании курса лечения (через 3-6 мес). Кроме того оценивали продолжительность процесса определения терапевтической чувствительности (в заявленном способе время на постановку реакции определяли путем хронометрирования), а также побочных эффектов при применении кетотифена, например сонливости, сухости во рту, нарушение концентрации и внимания, головокружение, прибавка веса, тромбоцитопения.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием критериев Вилкоксона, Вилкоксона Манна Уитни, Фишера (9).

Результаты представлены в табл.4.

Из данных табл.4 видно, что прогнозируемый с помощью заявленного способа терапевтический эффект кетотифена в 95% случаев подтвержден клиническим наблюдением за больными как в течение срока в 1 мес, предусмотренного способом-прототипом, так и в течение всего курса лечения 3-6 мес. Отсутствие подтвержденного прогноза у 3 больных обусловлено тем, что у 1 больного препарат вызвал побочный эффект (тромбоцитопения 30•10⁹ тромбоцитов/л, носовое кровотечение), в связи с чем препарат пришлось отменить через неделю после начала его приема, когда клинического эффекта еще не могло быть отмечено. У 2 больных родители давали препарат нерегулярно (1 раз в день, делали перерывы в лечении по несколько дней), что возможно и явилось причиной отсутствия терапевтического эффекта при использовании препарата. Кроме того, из табл. 4 следует, что заявляемый способ обеспечивает сокращение процесса определения в 144-180 раз (p<0,001). Предложенный способ позволяет также снизить количество лиц, у которых применение кетотифена вызывает "бесполезные" побочные эффекты, не оправданные возможностью получения терапевтического эффекта препарата.

Таким образом, заявляемый способ, обеспечивающий возможность до начала лечения выявлять больных, лимфоциты которых обладают специфическими морфо-функционалными особенностями, обуславливающими совпадение клинически значимых пространственных и энергетических характеристик лимфоцита и препарата "кетотифен", позволяет с помощью реакции in virto прогнозировать наличие или отсутствие клинического эффекта кетотифена и отобрать больных, у которых применение препарата будет заведомо эффективным. Это позволяет приблизительно в 160 раз сократить продолжительность процесса определения терапевтической чувствительности каждого конкретного пациента, что в свою очередь приводит к сокращению экономических затрат на лечение больного. Кроме того, заявляемый способ безопасен для больного, т.к. исключен контакт больного с лекарством, что позволяет избежать побочных эффектов, отмечающихся приблизительно у 50% больных, получающих лечение, и проявляющихся сонливостью, сухостью во рту, снижением концентрации внимания, головокружением, прибавкой в весе.

1. Студеникин М.Я. Соколова Т.С. Аллергические болезни у детей. М.Медицина, 1986, с.191. (прототип).

2. Машковский М.Д. Лекарственные средства (Пособие для врачей). М.Медицина, 1993, ч.1 с.364.

3. Балаболкин И.И. Бронхиальная астма у детей. М.Медицина, 1985, с.130.

4. Федосеева Г.Б. Хлопотова Г.П. Бронхиальная астма. Л.Медицина, 1988, с.207.

5. Friedman I.F.A. Kototfen: 6 monH "after-action. gn: ChiLdren and allergy. Copenhagen, 1981, p.36-43.

6. Аннотация к препарату ЗАДИТЕН фирмы САНДОЗ (ИНДИЯ) А.О.

7. Фримель Г. Иммунологические методы. М. Медицина, 1987, с.321.

8. Dustin M. L. Springer T.A. Role of lynohocyte adhesion receptos in transient interaction and cell locomotion. Annu.Rev.vumuroli, 1991, k.9, p. 27-66.

9. Гублер Е.В. Вычислительные методы анализа и распознавания патологических процессов. М. Медицина, 1978, с.70-85.

Использование: в медицине, а именно в аллергологии, для отбора больных с аллергическими заболеваниями, у которых лечение кетотифеном будет заведомо эффективным. Задача: создание способа, обеспечивающего возможность до начала лечения in vitro выявлять больных, лимфоциты которых обладают специфическими морфо-функциональными особенностями, обуславливающих совпадение клинически значимых пространственных и энергетических характеристик лимфоцита и препарата. Сущность изобретения: перед началом терапевтического воздействия исследуют кровь больного in vitro. При этом взвесь лимфоцитов больного делят на две части, в контрольную пробу вносят растворитель, в опытную пробу вносят раствор кетотифена в конечной концентрации 100 мг/мл. Инкубируют обе пробы в термостате в течение 2 ч, затем подсчитывают содержание неадгезированных лимфоцитов в каждой пробе и при снижении их количества в опытной пробе на 30% и более по сравнению с контрольной определяют терапевтическую чувствительность больного к кетотифену. 4 табл.

Способ определения терапевтической чувствительности к кетотифену больных с аллергическими заболеваниями путем исследования реакции организма на воздействие препарата, отличающийся тем, что перед началом терапевтического воздействия исследуют кровь больного in vitro, при этом взвесь лимфоцитов больного делят на две части, в контрольную пробу вносят растворитель, в опытную пробу раствор кетотифена в конечной концентрации 100 мг/мл, инкубируют обе пробы в термостате в течение 2 ч, затем подсчитывают содержание неадгезированных лимфоцитов в каждой пробе и при снижении их количества в опытной пробе на 30% и более по сравнению с контрольной определяют терапевтическую чувствительность больного к кетотифену.