СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА ВОЗБУДИТЕЛЯ ЛИХОРАДКИ КУ Российский патент 2004 года по МПК A61K39/02 

Изобретение относится к медицине, в частности к микробиологии и касается получения высокоактивного антигена из коксиелл Бернета для последующего его использования в диагностике лихорадки Ку.

Решающую роль в диагностике лихорадки Ку играют серологические методы исследования (Горбачев Е.Н., Токаревич Н.К.// Журн. микробиол. - 1995. - №3. - С.99-102). РСК, НМФА, ИФА и др. являются широкоприменяемыми в клинических лабораториях, простыми и чувствительными методами. Эффективность этих тестов зависит от качества получаемых антигенных комплексов возбудителя, на основе которых в конечном счете получают диагностические иммуноглобулины. Зависимость чувствительности метода от качества антигенного комплекса приведена в работе О.Ю. Сосниной с соавт. (Журн.микробиол. - 1995. - №3. - С.59-62), в которой описаны подходы к разработке технологии получения корпускулярного антигена C.bumetii, предназначенного для выявления антител против возбудителя лихорадки Ку.

Основными этапами получения антигенов риккетсий и, в частности, C.bumetii являются культивирование их в куриных эмбрионах, инактивация, гомогенизация и центрифугирование. С целью повышения степени очистки и выхода антигена полученный после высокоскоростного центрифугирования осадок подвергают фильтрации через стеклянные или нитроцеллюлозные фильтры, обработке хлоридом магния, тритоном Х-100, п-октил-бета-Д-глюкопиранозидом и другими реагентами. Однако трудоемкость, многоступенчатость способов, необходимость использования дорогостоящих реагентов ограничили применение этих методик (Пантюхина А.Н., Петров В.Ф., Александрова Л.В.// Журн. микробиол. - 1998. - №2. - С.51-54., Яблонская В.Я., Тарасевич И.В., Дюйсалиева Р.Г. и др.// Вопр. риккетсиологии. - М., 1984. - С.87-89).

Наиболее близким аналогом предлагаемому способу является способ получения антигена риккетсий, разработанный В.А. Яблонской, И.В. Тарасевич и В.А. Макаровой (Авт. свид. SU (1) 1392689, 1986 г.), который предусматривает последовательную обработку полученного после центрифугирования гомогената осадка 0,3-1%-ным раствором трипсина, 4-10%-ным раствором полиэтиленгликоля с м.м. 4000 или 6000 в присутствии 0,1-0,4% на объем суспензии натрия сульфат декстрана 500 и затем 5-15% хлороформа.

Целью изобретения является получение высокоактивного антигена возбудителя лихорадки Ку (C.burnetii, штамм М-44) более экономичным, быстрым и простым методом.

Поставленная цель достигается тем, что для упрощения и ускорения способа получения высокоактивного антигена гомогенизированную взвесь обрабатывают в равном объеме эфиром, в дальнейшем подвергают воздействию подкисленного формамида в течение 16-18 ч, затем добавляют подкисленный охлажденный до (-10)-(-20)°С этанол, центрифугируют при 3000-4000 об/мин в течение 30 минут, в последующем осаждают антиген из надосадка с помощью подкисленного охлажденного ацетона, центрифугируют взвесь при 3000-4000 об/мин, растворяют белый осадок в физиологическом растворе и стандартизируют его по содержанию белка.

Пример 1. Получение высокоактивного антигена возбудителя лихорадки Ку по предлагаемому методу.

Для культивирования C.burnetii использовали 6-суточные растущие куриные эмбрионы (РКЭ). В желточные мешки (ж.м.) РКЭ вводили по 0,25 мл суспензии C.burnetii, (штамм М-44), в разведении 1:150. Зараженные РКЭ инкубировали при t +36°С и влажности 45%. На 9-е сутки после гибели >50% эмбрионов все РКЭ вскрыли и выделили ж.м., содержащие C.burnetii. Накопление коксиелл в выделенных ж.м. подтвердили МФА. Гомогенизировали в стеклянном флаконе с бусами и приготовили суспензию на забуференном физиологическом растворе в соотношении 1:4. Взвесь отмыли в равном объеме эфира и добавили формамид в соотношении 1:10, рН 5,0. Оставили на ночь и затем добавили подкисленный охлажденный до -10°С этанол. Центрифугировали при 3500 об/мин в течение 30 мин. Осадок промыли 70° этанолом и снова центрифугировали. Надосадки объединили и добавили подкисленный охлажденный ацетон в соотношении 1:5, рН 4,0. Осадок отделили центрифугированием при 3500 об/мин в течение 30 минут, добавили физиологический раствор (рН 7,2) до первоначального объема. Выход продукта составил 300 мг влажного веса антигена риккетсий из 1 г овокультуры C.burnetii.

Пример 2. Получение антигена возбудителя лихорадки Ку по методу Яблонской В.А. и соавт. На 9-е сутки после заражения (пример 1) к желточным мешкам добавляли гипертонический раствор КСl и 0,5% формалина в конечной концентрации из расчета 3 мл на 1 г и выдерживали 15 суток. Гомогенизировали, обрабатывали трипсином и полученную взвесь подвергали высокоскоростному центрифугированию с целью осаждения C.burnetii. Осадок ресуспендировали в физиологическом растворе и проводили очистку ПЭГом по описанной в прототипе методике. Выход продукта составил 3,5 мг влажного веса чистых риккетсий из 1 г овокультуры C.burnetii.

Пример 3. Контрольный препарат готовили из неинфицированных желточных мешков аналогичным способом, описанным в примере 1.

Результаты сравнения активности полученных антигенов представлены в таблице.

Таким образом, стало возможным получение антигена в течение суток. Выход антигена по разработанному способу составил 30%. Титр антигена в РСК -1:256, в ТИФА - 1:1280.

Предлагаемый способ получения антигена C.burnetii прост, доступен, нетрудоемок, не требует высокоскоростного центрифугирования, многоэтапной очистки, длительного времени и позволяет получить высокий процент выхода конечного продукта.

Рекомендуется для диагностики лихорадки Ку.

Изобретение относится к медицине, в частности к микробиологии, и касается получения высокоактивного антигена из коксиелл Бернета для последующего его использования в диагностике лихорадки Ку. Сущность способа заключается в том, что после гомогенизации желточных мешков куриных эмбрионов, инфицированных аттенуированным штаммом M-44 C.burnetii, их обрабатывают 1-2 раза эфиром. Эфирную фазу удаляют, а в оставшуюся добавляют подкисленный формамид. Через 16-18 ч добавляют охлажденный подкисленный этанол, центрифугируют. К надосадку добавляют охлажденный подкисленный ацетон, затем взвесь центрифугируют, осадок растворяют в физиологическом растворе, рН 7,2. Техническим результатом является получение высокоактивного антигена возбудителя лихорадки Ку с высоким процентом выхода конечного продукта. 1 табл.

Способ получения антигена возбудителя лихорадки Ку, включающий культивирование C.burnetii (штамм М-44) в куриных эмбрионах, гомогенизацию полученной биомассы, центрифугирование и выделение антигена, отличающийся тем, что гомогенизированную взвесь обрабатывают в равном объеме эфиром, в дальнейшем подвергают воздействию подкисленного формамида в течение 16-18 ч, затем добавляют подкисленный охлажденный до (-10)-(-20)°С этанол, центрифугируют при 3000-4000 об/мин в течение 30 мин, в последующем осаждают антиген из надосадка с помощью подкисленного охлажденного ацетона, центрифугируют взвесь при 3000-4000 об/мин, растворяют белый осадок в физиологическом растворе и стандартизируют его по содержанию белка.