Штамм Pichia pastoris Y-4349 - продуцент альфа-фетопротеина человека, способ получения альфа-фетопротеина и композиции его содержащей Российский патент 2025 года по МПК C12N1/21 

Область техники

Изобретение относится к микробиологии, генной инженерии, биотехнологии, молекулярной биологии. Группа изобретений, раскрывает: рекомбинантный штамм Pichia pastoris, в который встроен синтетический ген с адаптированными для P. pastoris кодонами, кодирующий альфа-фетопротеин человека (АФП); способ получения АФП, способ получения АФП и фармацевтической композиции, которая может быть использована в противоопухолевой терапии.

Уровень техники

Альфа-фетопротеин (АФП) - основной компонент эмбриональной сыворотки крови млекопитающих, который синтезируется висцеральной эндодермой желточного мешка и клетками эмбриональной печени. Сразу после рождения уровень АФП в сыворотке резко снижается, и его экспрессия практически не определяется у взрослых здоровых особей. Синтез АФП возобновляется при возникновении опухолей печени и герминогенных тератобластом, и в меньшей степени - при химических и механических повреждениях печени, сопровождающихся регенерацией, например, при остром вирусном гепатите или циррозе.

АФП человека - гликопротеин, состоящий из 590 аминокислот и содержащий около 4% углеводного компонента. Одно из основных свойств АФП - нековалентная сорбция различных низкомолекулярных химических веществ, таких как полиненасыщенные жирные кислоты, стероидные гормоны, металлы, ретиноиды, гидрофобные антибиотики и другие.

Молекула АФП состоит из трех глобулярных структурных доменов, скрепленных 15 межцепьевыми дисульфидными связями. Кроме того, важным структурным элементом молекулы АФП является карбогидратный компонент, который обеспечивает правильную рецепцию и функционирование молекулы. Кроме полипептидной цепи, состоящей из 590 аминокислотных остатков, в структуру молекулы сывороточного эмбрионального АФП или секретируемого клетками гепатокарциномы, входит одна олигосахаридная группа, связанная с аспарагином по N-типу гликозилирования. Структура олигосахаридной цепи АФП гетерогенна и зависит от различных факторов: стадии развития гепатокарциномы или стадии развития эмбриона. Олигосахариды влияют на структурные свойства молекулы АФП, входят в состав антигенных детерминант и рецепторсвязывающих центров.

Традиционно источником для получения АФП является сыворотка крови беременных женщин, пуповинная эмбриональная сыворотка или асцитная жидкость раковых больных. Все эти источники, очевидно, являются неприемлемыми для получения белкового препарата медицинского назначения, во-первых, в связи с крайне ограниченным доступом к сырьевому источнику и низкому содержанию в нем АФП, и, во-вторых, в связи с постоянно возрастающим риском заражения вирусами или прионами.

Рекомбинантный АФП (АФП), экспрессированный в бактериальных клетках, негликозилирован, что является важным отличием от сывороточного АФП. Он обладает структурными и функциональными свойствами, отличающими его от сывороточного аналога, и также от рекомбинантного АФП, экспрессированного в дрожжевых системах.

При экспрессии гетерологичных белков в дрожжах осуществляется их гликозилирование по тем же аминокислотным остаткам, как и у сывороточного аналога, но структура самих олигосахаридов сильно различается по составу, длине и разветвленности цепи, что также предопределяет определенные различия в структурных и функциональных свойствах соответствующих белков. АФП может избирательно поглощаться клетками, экспрессирующими специфические АФП рецепторы (АФПР), такими как эмбриональные клетки, стволовые клетки, активированные иммунные клетки, раковые клетки или клетки, трансформированные определенными типами ретровирусов. Нормальные зрелые клетки теряют способность поглощать АФП и не экспрессируют специфические АФПР. На основе этого свойства АФП предложены методы терапевтического использования АФП для целевой доставки в опухоль цитостатиков и других веществ, подавляющих рост раковых клеток (Deutsch H.F. (1994) J. Tumor Marker Oncol. 9: 11-14).

АФП обладает рядом функциональных свойств, которые в настоящее время интенсивно исследуются. Классические представления об АФП, как об аналоге эмбрионального сывороточного альбумина, в настоящее время дополняются данными о способности АФП осуществлять регуляцию роста, развития и запрограммированной гибели клеток (Mizejewsky G.J. (2002) Expert Rev. Anticancer. Ther. 2: 89-115).

В частности, было показано, что АФП, аналогично сывороточному и культуральному аналогу, способен подавлять рост эстроген-зависимых опухолевых и нормальных тканей (Bennett, J.A. et al., (1997) Breast Cancer Res. Treat. 45, 169-179; Bennet, J.A. et al., (1998) Clinical Cancer Research, 4, 2877-2884).

Эти свойства АФП, а также повышенная селективность поглощения АФП раковыми клетками являются основой для использования его в медицине в качестве терапевтического препарата при лечении аутоиммунных (патент США № 5965528) и онкологических заболеваний (патент США № 6416734; Mizejewsky G.J. (2002) Expert Rev. Anticancer. Ther. 2: 89-115).

Однако применение природного АФП в качестве лекарственного средства технологически невозможно из-за дефицита сырья.

Было показано, что АФП, экспрессированный в Escherichia coli сохраняет иммунорегуляторную и онкосуппрессивную активность эмбрионального аналога.

Основными недостатками этих экспрессионных систем являются неспособность к секреции гетерологичного белка и крайне низкий уровень его продукции.

Кроме того, получение целевого продукта из биомассы рекомбинантных штаммов-продуцентов требовало проведения дополнительных процедур денатурации и ренатурации, что приводило к значительному снижению выхода продукта и, как следствие, значительно повышало его себестоимость. Также, в случае использования бактериальных экспрессионных систем немаловажной является проблема загрязнения продукта липополисахаридами оболочки, обладающими эндотоксической активностью.

Известен способ получения штамма-продуцента АФП человека, описанный в работах (Yamamoto et аl. (1990) Life Science, 46:1679-1686; патент США №5206153A). В этих источниках раскрыт дрожжевой штамм-продуцент Saccharomyces cerevisiae с внутриклеточной продукцией АФП человека, аминокислотная последовательность которого содержит дополнительный участок, соответствующий сигнальному пептиду АФП крысы. Данное изобретение идентифицирует продукт секреции дрожжевого штамма, обладающий свойствами зрелого АФП человека и имеющий первичную последовательность, полностью соответствующую последовательности зрелого АФП человека. Эта особенность отличает указанный продукт от заявленных ранее в работах (Yamamoto et аl. (1990) Life Science, 46:1679-1686; патент США №5206153A). Кроме того, недостатком этого штамма, описанного в цитируемых работах, является отсутствие механизмов внутриклеточной сборки и секреции АФП в культуральную жидкость, что существенно удорожает и усложняет процесс получения очищенного рекомбинантного АФП в препаративных количествах и дает крайне низкий уровень продукции АФП. Кроме того, авторы работ (Yamamoto et аl. (1990) Life Science, 46:1679-1686; патент США №5206153 A) получили модифицированный рекомбинантный АФП, последовательность которого содержит также сигнальный и линкерный пептид, что ограничивает возможность его медицинского применения из-за модификации структуры белка, приводящей к изменению иммунологической специфичности и, как следствие, увеличению риска иммунореактивной патологии при внутривенном или подкожном введении.

Недостатком этих изобретений является относительно большое время протекания основной реакции.

Известен также способ, защищенный патентом US 7163698 B2, представляющий собой синтез полимера PLGA с использованием пептидных векторных молекул и активирующего агента EDC, при котором используют органические фазы во время реакции конъюгации для получения модифицированного полимера, после чего получают полимерные частицы.

Известны также способы получения конъюгатов противоопухолевых препаратов с антителами, выступающими в качестве векторных систем (WO 2016036794 A1, WO 2014119624 A1), в которых в качестве векторных молекул используются антитела.

Недостатком указанных изобретений является тот факт, что применяемые векторные молекулы не обеспечивают эффективную таргетность в отношении опухолевых клеток-мишеней, а также характеризуются относительно низкой концентрацией препарата в конечном конъюгате. Помимо этого, способы отличаются относительно высокой сложностью, вызванной необходимостью введения дополнительного линкера для получения векторной системы.

Известны также работы, в которых представлены результаты по применению в качестве вектора бомбезина (BBN) (Hitesh Kulhari. Peptide conjugated polymeric nanoparticles as a carrier for targeted delivery of docetaxel / Hitesh Kulhari, Deep Pooja, ShwetaShrivastava et al. // Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 117 - 2014- P. 166-173), система направленной доставки на основе полимерных частиц с использованием моноклональных антител (Li Wang. Monoclonal antibody targeting MUC1 and increasing sensitivity to docetaxel as a novel strategy in treating human epithelial ovarian cancer / Li Wang, Hongmin Chen, Fen-gHua Liu et al. // Cancer Letters - 2011 - Volume 300 - Issue 2, 28 - P. 122-133). В ряде других работ в качестве векторной молекулы для доставки противоопухолевых препаратов используют белок альфа-фетопротеин (АФП) человека, т.к. он имеет рецепторы на поверхности опухолевых клеток (Северин E.C. Новые подходы к избирательной доставке лекарственных препаратов в опухолевые клетки. / Северин Е.С. // Успехи химии. - 2015. - Т. 84. - С. 43-60). В патентах РФ представлены данные по разработке ряда препаратов на основе АФП и способах их получения из природных источников (RU 2121350 С1, 10.11.1998; RU 2123009 С1, 10.12.1998; RU 2154468 С1, 09.11.1999; RU 2105567 С1, 27.02.1998).

В патенте US 20090068115 B2 описан способ активации карбоксильных групп полимерных частиц с использованием EDC, для чего проводят реакцию в 0.1 М буфере TEMED, pH 4.8, а также дальнейшую очистку с помощью диализа.

Недостатком способа является относительно большие временные затраты.

В заявке US 2010015051 A1 описан способ конъюгации в водных средах в боратном буфере при слабокислых значениях pH, причем избыток белка трансферрина удаляют ультрацентрифугированием.

Недостатком способа является относительно большая сложность и относительно большие временные затраты.

В патенте RU 2317102 C1 описано использование в качестве векторной молекулы пептида QMTOVNOG - аналога фрагмента альфа-фетопротеина. В частности, предложено применение пептида формулы QMTOVNOG, являющегося аналогом фрагмента α-фетопротеина с 472-й по 479-ю аминокислоту, способного избирательно захватываться опухолевыми клетками, в качестве векторной молекулы для направленной доставки противоопухолевых препаратов в опухолевые клетки. Кроме того, предложен конъюгат пептида формулы QMTOVNOG с доксорубицином, в котором доксорубицин ковалентно присоединен к указанному пептиду через тиоэфирную связь, в котором ковалентная тиоэфирная связь между ними создана путем взаимодействия SH-группы производного пептида, полученного реакцией пептида с N-гидроксисукцинимидным эфиром S-ацетилтиогликолевой кислоты, и двойной связи малеимидной группы гидразона доксорубицина, полученного реакцией доксорубицина с 4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбонилгидразидом. Предложена также фармацевтическая композиция для лечения онкологических заболеваний, содержащая конъюгат доксорубицина с векторной молекулой в эффективном количестве и подходящий для внутривенного введения фармацевтический носитель, отличающаяся тем, что в качестве конъюгата доксорубицина она содержит предложенный конъюгат.

Недостатком этого конъюгата является относительно низкая таргетность в отношении опухолевых клеток-мишеней.

Одним из близких к предложенной системе направленной доставки является противоопухолевой пептидный препарат, созданный на основе рекомбинантного фрагмента альфа-фетопротеина (АФП) человека. Препарат способен связываться с рецептором альфа-фетопротеина и ингибировать эстрадиол-индуцированный рост клеток гормонозависимых опухолей, а также выполнять функцию векторной молекулы для направленной доставки химиотерапевтического препарата в опухолевые клетки (RU 2285537 C1, А61К 38/12, 20.10.2006).

Недостатком данного препарата является относительно низкая эффективность применения.

Наиболее близким техническим решением для данного изобретения является штамм-продуцент АФП человека, раскрытый в RU 2617943 C2, полученный на основе штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae, содержащих рекомбинантный ген АФП. Основным недостатком данного способа является относительно низкая производительность штамма-продуцента по целевому белку для его использования в промышленности.

Из уровня техники известен противоопухолевый препарат (RU 2451509 C1, А61К 31/337, 27.05.2012), представляющий собой стабильные наночастицы и включающий цитостатик, биодеградирующий полимер, поверхностно-активное вещество, криопротектор и векторную молекулу для адресной доставки частиц в пораженные органы и ткани, при этом в качестве цитотостатика содержит паклитаксел - 0,4÷1,0 мас.%, в качестве биодеградирующего полимера - сополимер молочной и гликолевой кислот (PLGA 50:50) - 14,0÷15,0 мас.%, в качестве поверхностно-активного вещества - сукцинилированный поливиниловый спирт - 3,5÷4,0 мас.%, в качестве векторной молекулы для адресной доставки частиц в пораженные органы и ткани - C-концевой домен альфа-фетопротеина (р3дАФП) - 0,1÷0,3 мас.%, а в качестве криопротектора - D-маннит - 75,0÷80,0 мас.%.

Недостатком наиболее близкого технического решения относительно предложенного противоопухолевого препарата является относительно низкая эффективность, обусловленная относительно низкой таргетностью в отношении опухолевых клеток, что снижает эффективность лечения и повышает общую токсичность при его применении.

Наиболее близким к предложенному способу является способ получения конъюгата полимеркапсулированного противоопухолевого агента из группы таксанов с активным фрагментом АФП, описанный в том же техническом решении (RU 2451509 C1, А61К 31/337, 27.05.2012), согласно которому 150,0 мг сополимера молочной и гликолевой кислот (PLGA-COOH 50/50), содержащего свободную концевую карбоксильную группу, растворяют в 1,5 мл хлороформа, к раствору добавляют 18,0 мг дициклогексилкарбодиимида и 10,0 мг N-гидроксисукцинимида (10-кратные молярные избытки по отношению к полимеру), реакционную смесь перемешивают в течение 2 ч при комнатной температуре и отделяют от выпавшего осадка дициклогексилмочевины с помощью фильтрации, к смеси прибавляют 5.0 мкл триэтиламина и 7,5 мг доксорубицина гидрохлорида, реакционную смесь перемешивают в течение 15 ч, очистку реакционной смеси от избытка доксорубицина производят с помощью трехкратной экстракции 0,1 М водным раствором соляной кислоты, продукт реакции очищают преципитацией в ледяном метаноле, осадок собирают центрифугированием при 18 тыс. g в течение 30 мин, предварительно выпарив из раствора хлороформ под вакуумом.

Еще одним недостатком способа является относительно узкая область применения, обусловленная тем, что он не может быть использован для получения противоопухолевого препарата, обладающего более высокой эффективностью, определяемой повышенной таргетностью в отношении опухолевых клеток и более низкой токсичностью при его применении.

Кроме того, известный способ отличается относительно большим временем проведения процесса. Дополнительно можно отметить, что поскольку операция очистки в известном способе заключается в центрифугировании и ультрафильтрации, то полученный конъюгат возможно отделить лишь от низкомолекулярных примесей и невозможно отделить несвязавшиеся молекулы белка, что может привести к снижению эффективности препарата за счет блокировки рецепторов на поверхности опухолевых клеток, что, в свою очередь, приводит к снижению уровня связывания целевого препарата.

Раскрытие сущности изобретения

Целью настоящего изобретения является разработка нового штамма - продуцента АФП человека на основе дрожжей Pichia pastoris, обладающего высокой продуктивностью, способа его культивирования и получения АФП, а также способа получения фармацевтической композиции рекомбинантного альфа-фетопротеина, конъюгированного с наноинкапсулированными противоопухолевыми субстанциями в системе таргетной доставки для лечения онкологических заболеваний.

Для достижения поставленной цели были решены следующие задачи:

- конструирование и синтез оптимизированной синтетической последовательности гена, кодирующего АФП человека для экспрессии в клетках Pichia pastoris;

- конструирование экспрессионной кассеты для обеспечения высокого уровня экспрессии гена АФП человека в клетках Pichia pastoris;

- трансформация клеток Pichia pastoris, указанной кассетой, с целью интеграции ее в состав хромосомной ДНК;

- отбор наиболее продуктивного клона штамма-продуцента Pichia pastoris, содержащего ген или несколько генов АФП человека в составе хромосомной ДНК;

- проведение мутагенеза отобранного штамма с целью увеличения продуктивности;

- разработка метода культивирования дрожжевого штамма-продуцента Pichia pastoris АФП человека;

- разработка метода выделения и очистки АФП человека из культуральной жидкости;

- разработка способа получения фармацевтической композиции рекомбинантного альфа-фетопротеина, конъюгированного с наноинкапсулированными противоопухолевыми субстанциями в системе таргетной доставки для лечения онкологических заболеваний.

Отличительной особенностью настоящего изобретения является штамм дрожжей Pichia pastoris, содержащий синтетическую последовательность гена, кодирующего АФП человека с адаптированными для P. pastoris кодонами. В результате экспрессии указанного гена в клетках Pichia pastoris в культуральную жидкость секретируется рекомбинантный белок АФП человека. Данный штамм был депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) под номером Y-4349.

Также в ходе данной работы был разработан способ культивирования указанного штамма продуцента, позволяющий получить высокий выход АФП человека. Концентрация АФП по результатам культивирования составила 300 мг/л и выход белка 95%.

Разработанный способ получения фармацевтической композиции рекомбинантного альфа-фетопротеина, конъюгированного с наноинкапсулированными противоопухолевыми субстанциями в системе таргетной доставки для лечения онкологических заболеваний, включает очистку АФП с использованием эксклюзионной, ионообменной хроматографии и хроматографии гидрофобного взаимодействия, получение наночастиц с инкапсулированным в полимер противоопухолевым цитостатиком методом гомогенизации высокого давления и технологию конъюгирования очищенного АФП с наночастицами.

Задачей, которая решается в предложенном изобретении, является разработка способа получения рекомбинантного альфа-фетопротеина, обладающего широким спектром применения, с высоким выходом и чистотой, а также фармацевтической композиции на основе АФП, конъюгированного с противоопухолевой субстанцией, инкапсулированной в наночастицы PLGA.

Техническим результатом заявленного изобретения является способ получения АФП с выходом до 300 мг/л и чистотой 95% и способ получения фармацевтической композиции на основе АФП.

Поставленная задача решается, а технический результат достигается тем, что разработан штамм Pichia pastoris, депонированный во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) под номером Y-4349, способ получения АФП и способ получения фармацевтической композиции, содержащей рекомбинантный альфа-фетопротеина.

Штамм дрожжей Pichia pastoris депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) под номером Y-4349, характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки:

Клетки округлой, слегка овальной формы, размером 5-10 мкм, часть клеток имеет на поверхности почки или соединена с дочерними клетками.

Культуральные признаки:

Клетки хорошо растут на полной органической среде YEPD - 2% пептона, 1% дрожжевого экстракта, 2% глюкозы или 1% глицерина.

Кроме того, клетки хорошо растут на минеральной среде M9 (Na₂HPO₄ 6 г/л, КН₂PO₄ 3 г/л, NH₄Cl 1 г/л, NaCl 0,5 г/л, 1М MgSO₄ 2 мл, 1М CaCl₂ 1 мл,

а также на других синтетических средах для дрожжей, содержащих в качестве источника углерода глюкозу (2%) или глицерин (1%).

При росте на твердых средах клетки образуют гладкие, круглые колонии с матовой поверхностью, светло-кремового цвета, край неровный.

При росте в жидких средах образуют интенсивную ровную суспензию. Культура имеет характерный запах метилотрофных дрожжей.

Физиолого-биохимические признаки:

Клетки растут в пределах от 4 до 35°С. Оптимальной температурой выращивания является 30°С. При росте в аэробных условиях клетки незначительно закисляют среду. Оптимум рН для роста составляет 4,5-6,5.

В качестве источника углерода клетки могут использовать многие простые соединения, такие как: глюкоза, глицерин, метанол.

В качестве источника азота клетки могут использовать минеральные соли в аммонийной форме, аминокислоты, мочевину.

Клетки способны к аэробному и анаэробному росту.

Существенными признаками штамма является отсутствие потребности в гистидине.

А также образование в ходе ПЦР фрагмента размером 1773 п.н. при использовании пары праймеров AFP-a и AFP-b (см. пример 1).

Штамм Pichia pastoris был депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) под номером Y-4349.

Осуществление изобретения

На фиг. 1 представлена физическая карта плазмиды pPIC-alfa-AFP.

Настоящее изобретение описано следующими не ограничивающими настоящее изобретение примерами.

Пример 1. Клонирование гена, кодирующего альфа-фетопротеин человека (АФП)

Оптимизированная последовательность АФП (SEQ ID NO: 1) была получена синтетическим путем и клонирована в дрожжевой вектора рР1С9. Кодон-оптимизация учитывает частоту использования кодона в конкретном организме-хозяине, в котором данная нуклеотидная последовательность экспрессируется, в данном случае в Pichia pastoris.

В результате была получена плазмида pPIC-alfa-AFP. Для проверки наличия гена АФП в плазмиде использовали пару праймеров:

AFP-a 5'- AGGACCTTACACCGTAATGAATA -3'

AFP-b 5'- AACACCTAGGGCAGCACGAGT -3'

При ПЦР образуется фрагмент ДНК размером 1773 п.н., который представляет собой ген, кодирующий альфа-фетопротеин человека.

Пример 2. Подготовка клеток к трансформации

Были проведены культивирование и заморозка клеток штамма GS115 Pichia pastoris. Клетки высевали в стерильных условиях на агар в среде YEPD (1%-ный дрожжевой экстракт, 2%-ный пептон, 2%-ная глюкоза, 1 мМ дитиотрейтол), культивировали при 30°С, затем пересевали в суспензию и культивировали ночь. Время удвоения числа в среде YEPD всех клонов составляло 2 часа. Часть клеток суспендировали в YEPD среде с добавлением 15% глицерина и замораживали при -86°С. Для получения компетентных клеток предварительно выращивали колонии клеток в чашке с агаром в YEPD среде при 30°С в течение 2 дней. Затем содержимое одной колонии выращивали в 10 мл YEPD среды при 30°С в течение ночи. Разбавляли суспензию в YEPD до плотности ОД₆₀₀ 0.2 и конечного объема 10 мл и выращивали культуру до ОД₆₀₀ 0-8 в течение 4 часов. Суспензию клеток центрифугировали 5 мин при 500 g, выливали супернатант, суспендировали в 10 мл раствора I из указанного ниже набора для трансформации, вновь центрифугировали и суспендировали осадок в растворе I, после чего клетки были компетентны к трансформации. Аликвоты компетентных клеток по 50-200 μ1 разливали в стерильные пробирки объемом 1.5 мл, которые хранили при температуре -86°С до использования.

Пример 3. Трансформация компетентных клеток

Для трансформации использовали EasyComp Transformation Kit, входящий в состав Pichia Easy Select Kit (Invitrogen).

К 50 мкл компетентных клеток добавляли 3 мкг (4 мкл) ДНК-конструкции, 1 мл раствора II из набора, перемешивали встряхиванием, инкубировали в течение 1 часа при 30°С, перемешивая раствор каждые 15 мин. Затем раствор инкубировали 10 мин при 42°С, разделяли на 2 микропробирки по 525 мкл, добавляли в каждую по 1 мл среды YEPD и инкубировали 60 мин при 30°С. После этого клетки центрифугировали 5 мин при 3000g, ресуспендировали в растворе III, добавляя его в каждую пробирку по 500 мкл, сливали суспензию из 2 пробирок в одну, вновь центрифугировали и ресуспендировали осадок в 150 мл раствора III. Полученную суспензию клеток рассевали в стерильную чашку 80 мм на агаровый гель, приготовленный на среде M9 с добавлением 2% глюкозы. Через 3 суток получали несколько десятков колоний на чашку. Клетки из колоний переносили на чашку с M9 и 2% глюкозой, расчерченную на 50 пронумерованных квадратов, и культивировали чашку 2 дня при 30°C. После этого чашку с культурами использовали для выращивания клеток в суспензии и их последующего тестирования. Наличие гена АФП в составе геномной ДНК отобранных штаммов проверяли ПЦР с использованием праймеров AFP-a и AFP-b.

Пример 4. Культивирование штамма Pichia pastoris AFP-1 и контроль экспрессии рекомбинантного белка в полученных штаммах

Культивирование проводят на жидкой среде YEPD (Бабьева И.П., Голубев В.И. Методы выделения и идентификации дрожжей. М.: Пищевая промышленность, 1979, 2-254) c добавлением 1% глюкозы в течение 24 ч, затем индуцируют экспрессию гена альфа-фетопротеина путем добавления 2% метанола каждые 24 ч в течение 5 суток. Количественно продуктивность трансформантов оценивают по количеству альфа-фетопротеина, образовавшегося в культуральной жидкости, для чего клетки осаждают центрифугированием и в отобранном супернатанте методом ИФА анализируют содержание альфа-фетопротеина. Для скрининга и контроля отобранных штаммов используют коммерческий ИФА - набор «ИФА-АФП» производства Алкор-био.

В результате проведенного скрининга был отобран штамм Pichia pastoris с наибольшей продуктивностью.

Пример 5. Проведение индуцированного мутагенеза штамма Pichia pastoris с целью увеличения продуктивности

Для проведения индуцированного мутагенеза клетки штамма Pichia pastoris, содержащий ген АФП, пересевали в 10 мл свежей YEPD среды c добавлением 1% глюкозы и выращивали в течение 12 ч. Затем культуральную жидкость переносили в пробирки типа эппендорф по 1,5 мл, клетки осаждали центрифугированием 5000 g, однократно промывали 1 мл физ. раствора и ресуспендировали в 1,5 мл стерильного физ. раствора. Индуцированный мутагенез проводили добавлением N-метил-N-нитро-N-нитрозогуанидина в концентрации мутагена 50 мкг/мл. Обработку проводили при 30°С в течение 30 минут. Затем клетки промывали от раствора нитрозогуанидина физ. раствором 3 раза, ресуспендировали в 1,5 мл физраствора, делали 10-кратные разведения и высевали на свежую агаризованную среду YEPD c добавлением 1% глюкозы. Чашки инкубировали в течение 2 суток при 30°С.

После проведения нитрозогуанидинового мутагенеза было протестировано около 100 колоний P. pastoris в результате чего в качестве продуцента альфа-фетопротеина человека был отобран штамм Pichia pastoris с продуктивностью 300 мг/л АФП.

Пример 6. Культивирование штамма-продуцента и анализ культуральной жидкости на содержание АФП

Для культивирования берут штамм Pichia pastoris, депонированный во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) под номером Y-4349, и проводят пересев клеток в стерильных условиях в чашку Петри на агар в среде YЕPD (1%-ный дрожжевой экстракт, 2%-ный пептон, 2%-ная глюкоза). Культивируют в течение 2 дней.

Затем содержимое одной колонии переносится в пробирку и выращивается в 10 мл YЕPD среды при 30°C в течение 24 часов. Инокуляция пробирок производится в ламинарном боксе с соблюдением асептических условий, в каждую пробирку добавляют 400 мкл 50% р-ра глюкозы, закрывают ватно-марлевыми пробками, а также колпачками из крафт-бумаги. Инокулированные пробирки ставят в шейкер-инкубатор на 24 часа при температуре 30°С, 200 об/мин.

После 24 часов, инокулят из пробирок переносят в предварительно простерилизованные колбы с питательной средой YEPD объемом 150 мл, добавляют по 6 мл 50% р-ра глюкозы в каждую колбу, закрывают ватно-марлевыми пробками, а также колпачками из крафт-бумаги. Инокуляция колб производится в ламинарном боксе с соблюдением асептических условий. Инокулированные колбы помещают в шейкер-инкубатор на 24 часа при температуре 30°С, 200 об/мин.

Через 24 часа содержимое колб переносят в простерилизованный ферментер с питательной средой YEPD, добавляют пеногаситель и добавляют 50% р-р глюкозы (4% от объема ферментера). Выставляются следующие параметры культивирования: температура 30°C, обороты 600 об/мин, расход воздуха - 1 л воздуха на 1 л среды в минуту, рН 6-6,5.

Через 9 часов после начала процесса культивирования, либо после истощения первоначального количества глюкозы в среде (о чем будет свидетельствовать скачкообразное повышение рН и рО₂) в ферментер добавляется 50% раствор глюкозы (4% от объема ферментера). По завершении роста биомассы, при соответствии всех параметров требуемым, ферментационная система переводится на режим индукции АФП метанолом. Процесс индукции продолжается в течение 5 суток. Режим питания - 0,6% метанола от объема реактора каждые 3 часа в течение первых 4 суток, далее 0,6% каждые 4 часа в течение следующих 2 суток. Процесс культивирования продолжается в течение 7 дней. Такой режим позволяет повысить производительность в несколько раз, выход АФП до 300 мг/л.

Пример 7. Выделение АФП из культурального раствора путем тангенциальной микрофильтрации на плоско-рамном фильтре

Полученную биомассу отделяют на плоско-рамном фильтре с порами 0,45 мкм методом тангенциальной микрофильтрации, площадь фильтра - не менее 1 кв. м, давление 0,05-0,1 бар).

Скорость фильтрации составляет 6 л/ч в начале процесса и 3 л/ч в конце процесса, биомассу промывают 4 раза, увеличивая общий объем среды в 3 раза. Выход по АФП на данной стадии составляет 95%.

Пример 8. Очистка АФП на 2-ступенчатом модуле ультрафильтрации

После микрофильтрации проводят концентрирование целевого белка АФП методом ультрафильтрации с 2-ступенчатым модулем (мембранными фильтрами с порами 10 кДа и 300 кДа) в следующем порядке:

1) культуральная жидкость, полученная после стадии очистки от биомассы, направляется на мембрану с порами 300кДа, материал волокон - полиэфирсульфон, для очистки от крупных примесей. Содержание АФП контролируется в целевом потоке (фильтрат);

2) фильтрат после мембраны с порами 300кДа направляется на мембрану с порами 10кДа, материал волокон - полиэфирсульфон, для концентрирования целевого белка АФП;

3) конечный концентрат АФП направляют на фильтрацию на плоском фильтре МФАС-ОС-1 с порами 0,22 мкм. Затем отфильтрованный концентрат направляют на стадию выделения АФП.

Выход по АФП на данной стадии составляет 95%. Выход от начала процесса выделения 90%.

Пример 9. Очистка АФП методом жидкостной хроматографии низкого давления

Выделение АФП проводится при помощи препаративной хроматографии в две стадии. Первая стадия - ионный обмен. Вторая стадия - хроматография гидрофобного взаимодействия.

1 стадия - ионный обмен на анионообменной смоле Sephadex А-50, 40-120 мкм.

Условия разделения - ступенчатый градиент, детектор УФ. Расход подвижной фазы - от 5 мл/мин.

Подвижные фазы:

• Буфер 1 (150 мМ - NaCl, 20 мМ - Na₂HPO₄ (pH 6,5))

• Буфер 2 (200 мМ - NaCl, 20 мМ - Na₂HPO₄ (pH 6,5))

• Буфер 3 (2М - NaCl, 20 мМ - Na₂HPO₄ (pH 5))

Колонку со смолой уравновешивают Буфером 1 до получения стабильного, неизменяющегося со временем сигнала, получаемого с детектора (базовой линии). Чтобы образец имел аналогичную Буферу 1 ионную силу и pH, к образцу добавляют необходимый объём 2М раствора NaCl (pH 6,5), содержащий 20 мМ Na₂HPO₄. Далее образец уравновешивают при перемешивании на магнитной мешалке примерно 15 мин. После уравновешивания начинают наносить образец на смолу. По окончанию нанесения образца начинают смывать с колонки слабо удерживаемые компоненты Буфером 1. При снижении сигнала до базовой линии переходят на Буфер 2, который имеет достаточную ионную силу для элюирования целевого белка (АФП). Далее собирают целевую фракцию. Момент окончания сбора целевой фракции - снижение сигнала с детектора до базовой линии. На следующем этапе осуществляется отмывка смолы от сильно удерживаемых компонентов Буфером 3. Элюат собирается в слив. Промывают колонку до получения базовой линии.

2 стадия - хроматография гидрофобного взаимодействия на смоле ToyoPearl Butyl 650 М,

1) Условия разделения - линейный градиент, расход подвижной фазы -20 мл/мин, детектор - УФ

Фаза А: дистиллированная вода;

Фаза Б: Буфер 4.

• Буфер 4 (2М - NaCl, 100 мМ - Na₂HPO₄ (pH 7,5))

Колонку уравновешивают Буфером 4 до получения стабильного, неизменяющегося со временем сигнала, получаемого с детектора (базовой линии). Чтобы образец имел аналогичную Буферу 4 ионную силу и pH, к образцу добавляют необходимый объем 4М раствора NaCl (pH 7,5), содержащий 100 мМ Na₂HPO₄. Далее образец уравновешивают при перемешивании на магнитной мешалке примерно 15 мин. После уравновешивания начинают наносить образец на смолу. По окончании нанесения образца начинают выполнять программу градиента.

Время, мин Фаза А Фаза Б 0→10 0 100 10→64 0→100 100→0 64→112 100 0

Элюат собирают в слив до перехода на дистиллированную воду. Как только сигнал с детектора начинает увеличиваться начинают собирать целевую фракцию (АФП). Момент окончания сбора целевой фракции - снижение сигнала с детектора до базовой линии. На следующем этапе осуществляется промывка смолы (20 об.% этиловый спирт). Элюат собирается в слив. Промывают колонку до получения базовой линии.

Анализ на чистоту готового продукта после очистки проводится методом иммуно-ферментного анализа, PAAG электрофорез в полиакриламидном геле, обращенно-фазный ВЭЖХ в УФ-области с спектро-фотометрическим детектором. Чистота полученного АФП - не менее 95%.

Выход по АФП на данной стадии составляет 80%. Выход от начала процесса выделения 72%.

Пример 10. Получение противоопухолевой субстанции, инкапсулированной в наночастицы PLGA

1. Приготовление исходного раствора PLGA с дактиномицином

Навеску PLGA («Purasorb») 3000 мг и навеску дактиномицина 100 мг растворяют в 200 мл смеси ацетон/хлороформ (3:2).

2. Приготовление исходного раствора поливинилового спирта.

Навеску ПВС 5 г растворяли в 1000 мл дистиллированной воды до полного растворения под визуальным контролем.

3. Получение наночастиц

3.1. Предварительное эмульгирование

В коническую колбу объемом 2000 мл помещают 1000 мл раствора ПВС (дисперсионной среды) и капельно вводят 200 мл раствора PLGA с ДМ (см. п. 1) в смеси ацетон/хлороформ (дисперсионной фазы) в течение примерно 20 мин при непрерывном перемешивании на магнитной мешалке.

После введения всего объема PLGA перемешивают пред-эмульсию в течение 25 мин при скорости 700-800 об/мин.

3.2. Вторичная гомогенизация

Применение гомогенизатора высокого давления

Гомогенизатор собирают и опрессовывают согласно инструкции по эксплуатации при давлении не менее 800 бар с максимальной скоростью потока.

В емкость из нержавеющей стали на 5000 мл, оснащенную системой охлаждения (рубашкой) переливают предварительную эмульсию и гомогенизируют ее при давлении 700-800 бар с максимальным раcходом через кольцевой гомогенизирующий клапан гомогенизатора в течение 25 мин. Температура теплоносителя (воды) внешней системы охлаждения жидкостного тракта гомогенизатора 20°С.

3.3. Удаление растворителей

Эмульсию переливают в круглодонную колбу объемом 2000 мл и удаляют растворители на роторном испарителе при следующих условиях:

• Температура воды в водяной бане постоянна и составляет 35°C;

• Скорость вращения ротора - 60 - 80 об/мин;

• Температура теплоносителя в конденсаторе - 8°C;

• Вакуум в начале процесса составляет до -600 мбар. Далее с интервалом 20-30 мин увеличивают вакуум на 50 - 100 мбар (до начала закипания раствора). Фиксируют время при достижении давления -900 мбар. Через не менее чем 90 мин отбирают пробу на анализ остаточных растворителей методом газовой хроматографии. Процесс удаления растворителей продолжают до объемной доли растворителей не более 0,01%. Примерное время процесса - 4 часа. Объем дисперсии после удаления растворителей составляет 600-800 мл.

Пример 11. Получение фармацевтической композиции АФП, конъюгированной с противоопухолевой субстанцией, инкапсулированной в наночастицы PLGA

К полученной дисперсии после удаления растворителей добавляют 100 мл MES буфера (2-(N-морфолино)этансульфоновая кислота) с концентрацией 21,3 г/л и pH 6. Далее доводят объём до 1000 мл дистиллированной водой. После дисперсию с MES буфером уравновешивают при перемешивании около 30 мин и добавляют линкеры (EDC и сульфо-NHS).

EDC добавляют в 5-кратном избытке по отношению к количеству карбоксильных групп полимерных частиц. После добавления EDC смесь инкубируют при перемешивании в течение 5-10 минут. Далее добавляют сульфо-NHS, и перемешивают дисперсию в течение 30 мин. Молярное соотношение EDC к сульфо-NHS составляет 400:1. EDC и сульфо-NHS предварительно растворяют в MES буфере (2,13 г/л, рН 6) в концентрациях 10 мг/мл и 0,1 мг/мл соответственно.

Затем весь объем дисперсии наносят на смолу смешанного типа, содержащую сильнокислотный катионит в Н-форме и сильноосновной анионит, для удаления свободных EDC и сульфо-NHS с использованием детектора по электропроводности. В качестве подвижной фазы используется дистиллированная вода. Расход 10 мл/мин.

Колонку уравновешивают дистиллированной водой. Далее наносят весь объем дисперсии. Как только сигнал, получаемый с детектора, начнет увеличиваться собирают фракцию в емкость со 100 мл раствора АФП в MES буфере (21,3 г/л pH 6). Расчёт количества АФП осуществляется исходя из массы НЧ в дисперсии и составляет 15% от массы НЧ. Содержимое емкости перемешивается в процессе сбора фракции на магнитной мешалке (700-800 об/мин). Завершают сбор фракции, когда сигнал с детектора снизится до уровня базовой линии. Емкость, содержащую фракцию НЧ с АФП, оставляют перемешиваться на магнитной мешалке ещё на 2 часа.

Весь объем дисперсии после конъюгации наносят на смолу смешанного типа, содержащую сильнокислотный катионит в Н-форме и сильноосновной анионит, для удаления свободных АФП и MES, с использованием детектора по электропроводности. В качестве подвижной фазы используется дистиллированная вода. Расход 10 мл/мин.

Колонку уравновешивают дистиллированной водой. Далее наносят весь объем дисперсии. Как только сигнал, получаемый с детектора, начнет увеличиваться собирают фракцию. После того, как образец закончится, промывают колонку дистиллированной водой. Завершают сбор фракции, когда сигнал с детектора снизится практически до уровня базовой линии.

Полученный раствор фармацевтической композиции АФП, конъюгированной с противоопухолевой субстанцией, инкапсулированной в наночастицы PLGA замораживают в жидком азоте и отправляют на лиофилизацию.

--->

Список последовательностей

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Штамм Pichia

pastoris Y-4349.xml" softwareName="WIPO Sequence"

softwareVersion="2.3.0" productionDate="2024-11-09">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode></IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>-</ApplicationNumberText>

<FilingDate></FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>-</ApplicantFileReference>

<ApplicantName languageCode="ru">-</ApplicantName>

<InventionTitle languageCode="ru">Штамм Pichia pastoris Y-4349 -

продуцент альфа-фетопротеина человека, способ получения

альфа-фетопротеина и композиции его содержащей</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>1</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>1776</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..1776</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>aggaccttacaccgtaatgaatatggcatcgcctcaatattagactcat

atcaatgcacagcagaaatttccctagccgatctggctacgatcttttttgcacaattcgtccaggaagc

cacgtacaaggaggtctcaaaaatggtgaaagatgctcttaccgccattgaaaaacctacgggcgacgag

caaagttctggttgcctagaaaaccagctaccagcattcctagaagagctttgccacgaaaaagagatcc

tagagaagtacggacattccgattgctgttcccaaagtgaagaaggccgtcataattgctttttagccca

caagaaacccactccagcttccatacctctgtttcaagtccccgagcccgttacatcatgcgaagcctac

gaggaagatagagagactttcatgaataagttcatatatgagattgctcgtaggcacccctttttgtacg

ctcccacaatacttctgtgggctgctaggtacgataagattattcccagttgctgcaaagcagagaatgc

tgtcgagtgctttcagacgaaagctgcaacggtaactaaggaattacgtgagtcctcattgttaaaccaa

catgcctgtgccgtcatgaagaacttcggtacacgtacatttcaggccatcactgtcaccaagttaagtc

agaaatttactaaagtgcaattcacggagatccaaaaactggttcttgatgttgcacatgttcacgagca

ctgttgtaggggtgatgtactagattgccttcaagatggtgagaaaatcatgtcctatatctgttcacaa

caggatacattgtctaacaagataactgagtgctgcaagctgacgaccctagaacgtggccaatgtatta

tccacgccgaaaatgacgagaagcctgagggtttgagtcctaatctgaatcgtttcttgggagatcgtga

tttcaatcaattctcctcaggcgagaaaaacatttttctagcatcctttgtccatgaatactcccgtaga

cacccacaacttgctgtgtctgtgatattgagggtggctaaaggctaccaggagcttcttgagaagtgtt

tccaaactgaaaatcctcttgaatgtcaagataagggcgaagaagagttgcaaaagtacattcaggaatc

ccaggcattggctaaaaggtcttgcggtctgtttcaaaaattaggtgaatattatctacagaatgctttc

ctagtcgcatacactaagaaggctccacaactgacatcttctgaactgatggctataacgagaaaaatgg

cagcaactgctgcaacctgctgccagctttcagaagacaaacttctagcctgtggagaaggtgctgcaga

tattatcattggacatctatgtataagacatgagatgacgccagtgaatccaggagttggtcaatgctgt

acgagttcctacgcaaatagaaggccctgtttcagttccctagtcgttgacgaaacatacgtcccccccg

cattttccgacgataaatttatcttccataaggatctatgtcaagcccaaggcgtggctctgcaaactat

gaaacaggaatttttgatcaatctagttaaacaaaagcctcagataactgaggagcagctggaagccgtc

attgccgacttttctggcctgttagagaagtgttgccagggacaggagcaagaagtttgtttcgcagaag

agggacaaaaacttatttctaagactcgtgctgccctaggtgtttaa</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к микробиологии, генной инженерии, биотехнологии, молекулярной биологии. Группа изобретений раскрывает рекомбинантный штамм Pichia pastoris, в который встроен синтетический ген с адаптированными для P. pastoris кодонами, кодирующий альфа-фетопротеин человека (АФП). Кроме того, описан способ получения АФП и фармацевтической композиции, которая может быть использована в противоопухолевой терапии. Техническим результатом заявленного изобретения является выход АФП до 300 мг/л, чистота АФП составляет 95%. 3 н. и 1 з.п. ф-лы, 1 ил., 11 пр.

1. Штамм Pichia pastoris – продуцент альфа-фетопротеина человека (АФП), депонированный во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) под номером Y-4349.

2. Способ получения АФП, включающий культивирование штамма Pichia pastoris Y-4349 при следующих условиях: культивирование проводят в среде YЕPD, затем содержимое одной колонии переносится в пробирку и выращивается в 10 мл YЕPD среды в течение 24 часов, далее в пробирку добавляют 400 мкл 50% р-ра глюкозы, 5 пробирок ставят в шейкер-инкубатор на 24 часа при температуре 30°С, 200 об/мин, после 24 часов содержимое каждой пробирки переносят в колбу с питательной средой YEPD объемом 150 мл и добавляют по 6 мл 50% р-ра глюкозы, через 24 часа содержимое 5 колб переносят в простерилизованный ферментер с питательной средой YEPD, добавляют пеногаситель и 50% р-ра глюкозы в объеме 4% от объема ферментера, культивирование осуществляют при температуре 30°С, 600 об/мин, расходе воздуха 1 л/мин, рН 6-6,5, через 9 часов после начала процесса культивирования либо после истощения первоначального количества глюкозы в среде в ферментер добавляется еще 4% от объема ферментера 50% раствора глюкозы, по завершении роста биомассы ферментационная система переводится на 5 суток в режим индукции АФП метанолом, полученную биомассу отделяют на плоско-рамном фильтре с порами 0,45 мкм методом тангенциальной микрофильтрации, осуществляют очистку АФП на 2-ступенчатом модуле ультрафильтрации, осуществляют 2-ступенчатую хроматографическую очистку АФП.

3. Способ получения АФП по п. 2, где на первой стадии хроматографической очистки проводится хроматография на анионообменной смоле А-50 с разделением белков по разнице зарядов, на второй проводится гидрофобная хроматография на смоле ToyoPearl Butyl 650 М.

4. Способ получения фармацевтической композиции, обладающей противоопухолевой активностью:

получают АФП способом по пп. 2, 3;

осуществляют конъюгирование АФП с наночастицами PLGA, в которые инкапсулирована субстанция, обладающая противоопухолевой активностью, при этом противоопухолевая субстанция представляет собой дактиномицин, а перед конъюгированием осуществляют подготовку наночастиц, для этого осуществляют добавление к дисперсии наночастиц PLGA, в которые инкапсулирован дактиномицин, MES буфера pH 6, перемешивают 30 мин, далее добавляют линкеры EDC и сульфо-NHS и перемешивают дисперсию в течение 30 мин, удаляют свободные EDC и NHS, уравновешивают колонку, наносят весь объем дисперсии, собирают фракцию в емкость с раствором АФП в MES буфере при перемешивании, емкость, содержащую фракцию наночастиц с АФП, оставляют перемешиваться на магнитной мешалке еще на 2 часа, удаляют свободные АФП и MES, уравновешивают колонку, наносят весь объем дисперсии, собирают фракцию, полученный раствор фармацевтической композиции АФП, конъюгированной с противоопухолевой субстанцией, инкапсулированной в наночастицы PLGA, замораживают в жидком азоте и отправляют на лиофилизацию.