РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК РС VА ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ РИБОЗИМА В ЭУКАРИОТИЧЕСКОЙ КЛЕТКЕ Российский патент 1997 года по МПК C12N15/86 C12N15/79 C12N15/11 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генной инженерии, представляет собой рекомбинантную плазмиду pCVA, предназначенную для транскрипции генов рибозимов в составе последовательностей вирус-ассоциированной PHK (VA PHK) аденовируса птиц FAV1 (CELO) в эукариотических клетках.

Рибозимы это молекулы PHK, обладающие каталитической активностью. В настоящее время они находят все более широкое применение в качестве противовирусных агентов и в генной терапии.

Для эффективного подавления генной экспрессии с помощью рибозимов необходим их молярный избыток над субстратом. Это может быть достигнуто с помощью высокого уровня транскрипции гена рибозима в клетке и при высокой стабильности рибозима.

Для решения этой задачи было предложено вводить гены рибозимов в состав генов, транскрибируемых PHK-полимеразой III [3] Ventura et. al. [9] вводили ген рибозима в состав гена VAI PHK аденовируса человека. Однако в предложенной конструкции рибозим терял при этом ферментативную активность из-за негативного влияния вторичной структуры молекулы VAI PHK аденовируса человека. Авторам пришлось вводить дополнительные последовательности, обеспечивающие посттранскрипционное укорочение 5'-конца молекулы, которое приводило к восстановлению ферментативной активности рибозима. А это в значительной мере усложнило генноинженерную конструкцию.

Технический эффект предлагаемого изобретения -создание плазмиды, предназначенной для эффективной экспрессии стабильного и биологически-активного рибозима в культуре эукариотических клеток.

Молекулярная масса плазмиды pCVA равна 952,4 кД (размер 2860 н.п.)
Эта плазмида содержит уникальный сайт между промоторными боксами гена VA PHK CELO, который может быть использован для клонирования генов рибозимов с целью их дальнейшей транскрипции в культуре эукариотических клеток.

Технический эффект достигается с помощью плазмиды pCVA, которая позволяет использовать в качестве носителя рибозима молекулы VA PHK аденовируса птиц CELO.

Изобретение поясняется чертежом.

Плазмида pCVA состоит из следующих элементов (см. чертеж):
вектор pUC1813 [5] размером 2680 н.п.

Mae I Cfr I фрагмент генома аденовируса птиц CELO размером 180 н.п. содержащий ген вирусассоциированной PHK [6]
Пример 1. Конструирование плазмиды pCVA.

Способ конструирования плазмиды, содержащей ген, заключается в том, что ДНК плазмиды pUC1813 [5] обрабатывают эндонуклеазой рестрикации Sma I и смешивают с индивидуальным Mae I Cfr I фрагментом генома аденовируса птиц CELO, предварительно обработанным фрагментом Кленова для превращения выступающих концов ДНК в тупые. Смесь обрабатывают ДНК-лигазой фага Т4 и используют для трансформации клеток E. coli DH5 α Трансформанты высевают на среду с ампициллином (устойчивость к ампициллину обусловлена генетическим маркером геном b-лактамазы), плазмидную ДНК из бактериальных колоний анализируют с помощью специфических эндонуклеаз и отбирают тот клон, который содержит векторную плазмиду pUC1813 [5] со вставкой фрагмента генома аденовируса птиц CELO длиной 180 н.п. Определение первичнной структуры ДНК рекомбинантной плазмиды pCVA секвенированием по методу Сенгера [8] подтвердило наличие в рекомбинантной плазмиде pCVA последовательности гена VA PHK CELO, которая полностью совпадает с ранее опубликованной последовательностью этого гена [6]
Пример 2. Клонирование гена рибозима против мPHK репортерного гена секретируемой плацентарной щелочной фосфатазы (SEAP) в состав плазмиды pCVA.

Клетки бактерии E. coli DH5 a, содержащие плазмидную ДНК pCVA, выращивают в 200 мл бульона до титра 10^o клеток/мл. Клетки осаждают центрифугированием (5000 g, 5 мин, +4^oC) и ресуспендируют в 35 мл раствора, содержащего 8% сахарозы, 0,5% тритона X-100, 50 мМ ЭДТА pH 8,0. Далее добавляют 2,5 мл свежеприготовленного лизоцима, быстро перемешивают и нагревают на кипящей водяной бане в течение 3 мин. Лизат центрифугируют (20 000 g, 30 мин, +4^oC), ДНК из супернатанта осаждают равным объемом изопропанола, осадок собирают центрифугированием (12 000 g, 20 мин, +4^oC) и ресуспендируют в 5 мл буфера (10 мМ трис-HCl pH 8,0). Окончательную очистку плазмидной ДНК проводят методом равновесного центрифугирования в градиенте плотности CsCl с бромистым этидием.

1 мкг ДНК плазмиды pCVA инкубируют с эндонуклеазой рестрикции Kpn 2 I в буфере, содержащем 33 мМ трис-ацетат, 10 мМ ацетат магния, 66 мМ ацетат калия, 0,5 мМ дитиотрейтол. Реакцию проводят 1 ч при 55^oC. Препарат депротеинизируют методом фенольной экстракции, ДНК осаждают этанолом и ресуспендируют в буфере для Т4 ДНК-лигазы, содержащем 66 мМ трис-HCl, pH 7,6, мМ MgCl₂, 5 мМ дитиотрейтола, 1 мМ АТФ.

ДНК искусственного гена рибозима против мРНК репортерного гена SEAP [1] соединяют с ДНК плазмиды pCVA, линеаризованной Kpn 2 I, с помощью ДНК-лигазы фага Т4 (30 000 ед./мл) из расчета 1 мкл фермента на 1 мкг ДНК. Инкубацию проводят в течение 10 ч при 12^oC.

Полученной смесью трансформируют клетки E.coli DH5 a следующим образом: 0,1 мл суспензии клеток E.coli DH5 a вносят в 20 мл питательного бульона LB и выращивают до титра 3•10⁸ клеток/мл. Клетки собирают центрифугированием (5000 g, 10 мин, 0^oC), суспендируют в 10 мл 50 мМ CaCl₂ и выдерживают 30 мин при 0^oC. Затем клетки повторно центрифугируют (5000 g, 10 мин, 0^oC), ресуспендируют в 1 мл 50 мМ CaCl₂. 100 мкл такой суспензии используют для трансформации. Смесь соединенных фрагментов ДНК инкубируют с обработанными клетками 1 ч при 0^oC и 2 мин при 42^oC. После 20-кратного разбавления бульоном LB трансформированные клетки подращивают 1 ч и высевают на агаризованную среду с ампициллином (100 мкг/мл).

Плазмидную ДНК, выделенную из ампициллинустойчивых колоний, выросших через 24 ч, анализируют с помощью гидролиза эндонуклеазой рестрикции Kpn 2 I. Отбирают плазмидную ДНК, обозначенную как pCVArib3, содержащую в своем составе олигодезоксирибонуклеотид гена рибозима размером 50 н.п. Окончательный анализ ДНК рекомбинантной плазмиды и определение ориентации гена рибозима относительно промоторных боксов VA PHK CELO проводят методом секвенирования по Сэнгеру [8]
Пример 3. Анализ транскрипции гена рибозима, клонированного в состав pCVA, в эукариотических клетках.

ДНК плазмиды pCVArib3 вводят в линию эукариотических клеток 293 [4] Для этого клетки выращивают на минимальной среде Игла с добавлением 5% фетальной сыворотки теленка. Клетки рассеивают за 24 ч до трансфекции. Буфер, содержащий 5 г/л HEPES, 8 г/л NaCl, 0,37 г/л KCl, 0,125 г/л Na₂HPO₄•2H₂O, 1 г/л глюкозы, pH 7,1, смешивают с ДНК плазмид и добавляют по каплям 2,5 M CaCl₂ (50 мкл/мл). Смесь инкубируют при комнатной температуре 30 мин и образующийся преципитат вносят в культуральную среду из расчета 1 мл преципитата на 10 мл среды. 6 мкг Плазмиды, несущей ген рибозима ([CVArib3), используют для трансфекции 3•10⁵ клеток в 3 мл культуральной среды.

Через 48 ч после трансфекции из клеток выделяют суммарную фракцию PHK по ранее описанной методике [7] 6 мкг PHK отжигают с избытком [γ-³²P] дАТФ-меченного специфического праймера, который комплементарен последовательности рибозима. Далее проводят ревертазную реакцию [7] с использованием AMV обратной транскриптазы -42^oC, 30 мин. Радиоактивно-меченные продукты этой реакции разделяют на 10%-ном полиакриламидном геле с 8 M мочевины и гель радиоавтографируют. Опыт показал, что произошло удлинение специфического праймера на 50 н. что в точности соответствует расстоянию от 5'-конца гена VA PHK CELO до сайта Kpn 2 I, по которому осуществлялось клонирование гена рибозима. Этот опыт подтверждает транскрипцию в эукариотических клетках гена рибозима, который интегрирован в состав VA PHK CELO. Уровень транскрипции может быть оценен как 10 пкг рибозима на 1 мкг тотальной PHK.

Пример 4. Ингибирование транзиентной экспрессии гена SEAP с помощью рибозима, транскрибируемого в составе VA PHK CELO, в линии клеток 293.

ДНК плазмид pCVArib3 и pBc12/RSV/SEAP [2] вводят в линию эукариотических клеток 293 [4] как описано в примере 3, 1 мкг ДНК плазмиды, продуцирующей SEAP (pBc12/RSV/SEAP), и 5 мкг плазмиды, несущей ген рибозима (pCVArib3) используют для трансфекции 3х10⁵ клеток в 3 мл культуральной среды. Определение ферментативной активности SEAP проводят спустя 48 ч после трансфекции по ранее описанной методике [2]
В результате эксперимента обнаруживается 50-процентное снижение ферментативной активности SEAP в культуральной жидкости клеток контрансфицированных ДНК плазмиды pCVArib3.

Таким образом, изобретение позволяет получить высокий уровень биологически-активного рибозима в культуре эукариотических клеток. Плазмида pCVA может быть использована в дальнейшем для клонирования и транскрипции в клетках эукариот генов рибозимов, направленных на ингибирование вирусных генов и клеточных онкогенов.

Литература
1. Захарчук А.Н. Доронин К.К. Карпов В.А. Кругляк В.А. Народицкий Б.С. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 1994, N 6, с. 8 - 12.

2. Berger, J. Hauber, R, Geiger, R. Cullen, B.R, Gehe, 1988, 66, 1 - 10.

3. Cotten, M, Birnstiel, M. EMBO J. 1989, 8, 3861 3866.

4. Graham, F. L. Smiley, J. Russel, W.C. Nairn, R. J. Gen. Virology, 1977, 36, 59 72.

5. Kay, R. MePherson, J. Nucleic Acids Res. 1987, 15, 2778.

6. Larsson, S. Bellet, A. Akusjarvi, G. J. Virol. 1986, 58, 600 - 609.

7. Sambrook, J. Fritsch, E.E. Maniatis, T. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

8. Sanger, F. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1977, 74, 5463.

9. Ventura, M. Wang, P. Ragot, T. Perricaudet, M. Saragosti, S. Nucleic Acids Res. 1993, 21, 3249 3255.

Использование: биотехнология, в частности генная инженерия. Сущность изобретения: сконструирована рекомбинантная ДНК pCVA, предназначенная для эффективной экспрессии стабильного и биологически активного рибозима в эукариотической клетке и состоящая из векторной плазмиды pUC 1813 и MaeI-CfrI - фрагмента размером 180 н.п. из генома аденовируса птиц CELO, содержащего ген вирусассоциированной РНК. 1 ил.

Рекомбинантная плазмидная ДНК РС VА для экспрессии рибозима в эукариотической клетке, имеющая молекулярную массу 952, 4 КД (размер 2860 н.п.), состоящая из ДНК векторной плазмиды pUC 1813 размером 2680 н.п. и Мае I Cfr I фрагмента генома аденовируса птиц CELO размером 180 н.п. включающего ген вирус ассоциированной (VA) РНК, содержащая уникальные сайты рестрикции: два сайта Hind III, Pst I, Sal I, Xba I, Bam HI и один сайт Sph I в векторе pUC 1813 и уникальный клонирующий сайт Кpn 21 в гене VA РНК CELO, генетические маркеры плазмиды: bla-ген.