СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ РЕВМАТОИДНОГО АРТРИТА Российский патент 2008 года по МПК A61K35/14 A61K31/196 A61P19/02 

Изобретение относится к области биологии и медицины, а именно к иммунотропному лечению аутоиммунных заболеваний.

Стандартное лечение ревматоидного артрита базируется на длительной неспецифической иммуносупрессивной терапии химиопрепаратами, которая не способна полностью прервать иммунопатологический процесс, не приводит к излечению заболевания и имеет значительные побочные эффекты. Недостаточная эффективность стандартных протоколов послужила основанием для поиска новых направлений системной терапии данного заболевания.

Современные представления об иммунопатогенезе РА основываются на нескольких концепциях, включая нарушения Т-клеточного гомеостаза. При РА происходит генетически детерминированная ранняя инволюция тимуса, результатом этого становится быстрое снижение притока новых Т-лимфоцитов, а поддержание постоянного количества обеспечивается путем ауторепликации CD4⁺клеток, уже прошедших антигенную презентацию (периферическая экспансия) [13]. Такие лимфоциты начинают делиться на периферии, что приводит к ускоренному старению популяции Т-лимфоцитов, к снижению антигенного разнообразия. Таким образом, нормальное количество Т-клеток обеспечивается отличающимся от нормы их составом. В основном, это олигоклональная масса состаренных многими делениями клеток, обладающих измененными генетическими, рецепторными и функциональными характеристиками [4, 13]. Инфильтрация данными клетками синовиальной ткани, а также стенок сосудов считается одним из механизмов поддержания воспаления и деструкции ткани суставов и сосудов при РА [10, 13].

В последние годы для лечения иммунопатологических состояний начали использоваться методы, основанные на воздействиях, изменяющих гомеостатические параметры. Учитывая, что периферическая экспансия CD4⁺клеток предполагает приобретение этими клетками фенотипа активированных клеток, необходима активация механизмов ограничения активированных клеток. Одним из новых направлений является иммунотерапия, нацеленная на активизацию системы Т-регуляторных клеток (Тр). Являясь составной частью системы естественной регуляции иммунного ответа, Тр клетки контролируют функционирование иммунной системы через взаимодействие с лимфоцитами, моноцитами, дендритными клетками, находящимися в активированном состоянии. При этом Тр клетки активно мигрируют в очаги воспаления и оказывают негативное влияние на клетки-мишени через контакт-зависимые (перфорин/гранзим опосредованный киллинг) и контакт-независимые (продукция противовоспалительных цитокинов - TGF-β и IL10) механизмы [9]. Накопленные данные о свойствах и механизмах действия Тр клеток инициировали работы по созданию новых клинических протоколов иммунотерапии аутоиммунных заболеваний, нацеленных на увеличение количества Тр клеток в организме больного [2, 3].

В настоящее время для лечении аутоиммунных заболеваний широко используются методы, основанные на вакцинации больных Т-клетками, несущими рецепторы против аутологичных антигенов [1, 5, 6]. Показано, что в результате иммунизации аутоиммунными Т-лимфоцитами генерируется два типа клеток: одни распознают идиотип, ассоциированный с Т-клеточным рецептором, другие, названные антиэрготипическими, супрессируют Т-клетки путем, не связанным с распознаванием идиотипических детерминант [7, 11, 15].

Антиэрготипические клетки менее изучены, но известно, что они реагируют на экспрессию на поверхности активированных Т-клеток маркера активации, названного эрготопом [2, 8]. В качестве эрготопа рассматриваются молекулы CD25 (альфа цепь рецептора IL2), CD122 (бета цепь рецептора IL2), HSP60. В экспериментальных работах показано, что при аутоиммунных заболеваниях происходит депрессия антиэрготипического ответа, но он может быть повышен путем вакцинации активированными Т-клетками или описанными эрготопами [3, 14].

Результаты предварительных клинических испытаний Т-клеточной вакцинотерапии в лечении аутоиммунных заболеваний свидетельствуют о том, что помимо нарастания Т-лимфоцитов, распознающих клонотипы вакцинальных аутологичных Т-клеток, накапливаются Т-лимфоциты, реактивные по отношению к аутологичным активированным Т-клеткам [1, 12, 14].

Ранее описанные способы лечения РА основаны на генерации антиидиотипического ответа, направленного на вариабельные фрагменты (идиотипы) рецепторов антигенспецифичных Т-лимфоцитов [16]. Для получения аутоантигенспецифичных Т-лимфоцитов используют постоянную или периодическую стимуляцию антигеном (группа белков коллагена), поэтому процесс наработки вакцинальных клеток довольно длительный и дорогостоящий.

Задачей настоящего изобретения является создание способа лечения ревматоидного артрита, основанного на активации механизмов супрессии аутоиммунных Т-лимфоцитов через индукцию антиэрготипического ответа.

Поставленная задача решается за счет использования аутологичных Т-лимфоцитов, выделенных из периферической крови и активированных с помощью анти CD3 антител и ИЛ-2. Терапия проводится в виде подкожных инъекций больному 1 раз в неделю в течение 4-х недель и далее поддерживающим курсом с частотой 1 раз в месяц в течение 1 года на фоне стандартной терапии цитостатическими препаратами.

Предложенный способ позволяет за счет вакцинации аутологичными активированными Т-лимфоцитами уменьшить клинические проявления, характеризующие тяжесть заболевания. Терапия аутологичными активировапнными Т-лимфоцитами сочетается со стандартной иммуносупрессивной терапией, не увеличивая побочных эффектов и осложнений последней. Способ является менее затратным и методически более простым, чем ранее описанные аналоги.

Способ осуществляется следующим образом.

Получение аутологичных активированных Т-клеток из периферической крови.

К 200 мл периферической крови, стабилизированной с гепарином, добавляют 10-20 мл 10% желатина (Промикс) и инкубируют 45 минут в термостате при 37°. Полученную в результате лейковзвесь собирают, разбавляют забуференным физиологическим раствором с ЭДТА (ЗФР-ЭДТА), содержащим на 100 мл раствора 2 мг тиенама (Мерк), 125 мкл гентамицина (KRKA) и 500 мкл FBS (Fetal Bovine Serum, HyClone); затем центрифугируют в градиенте фиколл-верографин (Sigma, Швеция) в течение 35 минут при 1,2 тыс. об/мин в центрифуге ОС-6. Образовавшееся кольцо мононуклеарных клеток собирают и отмывают трижды ЗФР-ЭДТА при 1,2 тыс. об/мин в течение 10 минут. Клеточный осадок ресуспендируют в 10 мл полной среды RPMI 1640 (ФГУП ГНЦ ВБ Вектор) (с добавлением 2 мг тиенама, 125 мкл гентамицина и 30 мг L-глутамина (ФГУП ГНЦ ВБ Вектор) на 100 ml среды) и подсчитывают количество клеток в камере Горяева. Все полученные МНК садят в культуральные матрасы (NUNC, Италия) из расчета 2 млн клеток на 1 мл полной среды с 10% FBS и активаторами (1 мкл/мл анти СD3 антител (НПЦ МедБиоСпектр) и 50 ед/мл IL-2 (ООО Биотех)). На 5-6 день (по состоянию культуры) заменяют 70% среды на новую с таким же составом. На 10-14 день клетки собирают, осаждают при 1,2 тыс. об/мин в течение 10 минут, ресуспендируют в 10 мл FBS и подсчитывают количество клеток. Добавляют FBS и DMSO (Riedel-deHaën, Германия) с таким расчетом, чтобы в результате получить 30 млн клеток на 1 мл FBS с 10% DMSO, и фасуют в криопробирки по 1 мл. Хранят клетки в морозильной камере при -80°С.

Перед введением к клеткам добавляют 10 мл физиологического раствора и осаждают в течение 5 минут при 1 тыс. об/мин в медицинской лабораторной центрифуге. Осадок ресуспендируют в 2 мл физиологического раствора и в таком виде вводят пациентам с кратностью 1 раз в неделю №4, далее поддерживающие инъекции 1 раз в месяц в течение 1 года.

Клинические исследования проводились в соответствии с протоколом, утвержденным Ученым советом и Этическим комитетом Института клинической иммунологии СО РАМН. От каждого пациента было получено информированное согласие. В исследование был включен 21 пациент с РА, средний возраст составил 48±14,89 (от 20 до 73-лет), длительность заболевания 12±10,2 (от 2 до 36 лет), Rg стадия II-IV. В качестве базисной терапии 16 больных получали метотрексат в дозе 7,5-10 мг/нед, 5 больных лефлюномид (арава) в дозе 20 мг/сут. Не допускалось использование других цитокин-содержащих препаратов в ходе всего исследования (интерфероны, колониестимулирующие ростовые факторы, беталейкин и т.д.), а также смена одних базовых препаратов другими и/или значительная вариация в дозах и использование кортикостероидов в любых вариантах. До лечения всем больным проводился сбор анамнестических данных, клиническое обследование больного, включающее клиническую оценку общего состояния, оценку суставного синдрома (счет боли, суставной индекс, индекс припухлости, уровень боли и тяжести болезни по визуальной аналоговой шкале (ВАШ)), оценку состояния здоровья (HAQ), исходные рентгенограммы кистей в прямой проекции. Через 1, 3 и 6 месяцев выполнялись контрольные исследования, включающие оценку качества жизни, индекс болезни DAS28, оценка суставного синдрома: число болезненных и припухших суставов, уровень боли и тяжести болезни по ВАШ, общий анализ крови, биохимический анализ крови, исследование ревматоидного фактора. Клиническая оценка эффективности в соответствии с критериями ACR. Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием программы Statistica, version 5, с применением критерия Wilcoxon и методов описательной статистики.

Схема иммунотерапии включала 4 еженедельных подкожных иммунизации и поддерживающие введения с частотой 1 раз в месяц. Вакцинальная доза составляла 2-3×10⁷ клеток. В процессе лечения не было отмечено развития местных и общих реакций на введение клеток.

По результатам наблюдения через 1 месяц лечения 2 из 21 пациента отвечали жестким критериям эффективности ACR 20, 5 пациентов приблизились, но не преодолели достоверного рубежа. Через 3 месяца 2 из 16 пациентов отвечали критериям эффективности ACR20. Через 6 месяцев ACR 20 ответ наблюдался у одного пациента, 5 из 14 пациентов требуют наблюдения (табл.2). У данных пациентов отмечено достоверное улучшение клинических параметров, характеризующих тяжесть заболевания: время утренней скованности, число болезненных суставов, уровень боли по ВАШ, из лабораторных показателей отмечено уменьшение уровня фибриногена в сыворотке крови (табл.1).

Таблица 1.
Динамика суставного синдрома и некоторых лабораторных показателей в процессе лечения Т-клеточной вакциной.ПоказательВремя исследованияДо лечения n=21Ч/з 1 мес n=21Ч/з 3 мес n=16Ч/з 6 мес n=14СОЭ (мм/ч)36,42±8,4431,71±10,1830,37±11,3731,57±13,04Гемоглобин (г/л)116,4±10,88117,38±11,83113,75±10,42114,35±9,17СРП (мг/л)31,95±33,6328,0±33,646,12±78,0925,28±26,01Фибриноген (г/л)3,77±0,73,4±1,093,15±1,18*3,38±1,89Ревматоидный фактор (Ln)2,41±0,732,14±1,142,16±1,182,19±1,29Суставной индекс (баллы)21,28±19,918,61±21,3216,93±20,99,78±9,81Счет боли (баллы)29,76±26,1724,71±23,5624,25±22,3818,28±14,56#Индекс припухлости (баллы)7,8±6,767,47±7,759,68±9,897,28±7,3HAQ1,28±0,751,16±0,741,16±0,61,1±0,51Утренняя скованность (мин)115,4±133,536,67±65,02*#34,06±35,27*#26,07±32,11*#Уровень боли по ВАШ (мм)51,42±13,245,95±21,543,25±17,48#44,6±10,27*#DAS285,96±2,035,8±2,245,14±2,0*#4,7±1,38*^*- p<0,05 при сравнении с данными до лечения (Wilcoxon)^#- р<0,05 при сравнении с данными до лечения (T-test for dependent samples)

Таблица 2.
Оценка эффективности по критериям ACR через 1, 3, 6 месяцев.ACR 1 мес (21 человек)ACR 3 мес (16 человек)ACR 6 мес (14 человек)БСЧПССОЭОбщая оценка активности по мнению пациентаУровень боли по ВАШHAQЧБСЧПССОЭОбщая оценка активности по мнению пациентаУровень боли по ВАШHAQЧБСЧПССОЭОбщая оценка активности по мнению пациентаУровень боли по ВАШHAQ 5050                     502020202050      507020707020205050202020  2050   202020  505020 2020       50                 70 202070            2070                  50     2020  202050502020 2050 2020   2020 5020 502020    20       20 20    20 20   20 202020   20 20      5050 202020 70 205050   20        20  2020 5070 2020502020    5070              20 50 2050    2020202020    2050    2020   20  50  50 20502020 202020  202020     5020205020     2020   2070   202020202050    2020502020  7050   205020205070            

ЧБС - число болезненных суставов

ЧПС - число припухших суставов

СОЭ - скорость оседания эритроцитов

HAQ - функциональный тест оценки здоровья

Общая оценка активности по мнению пациента

Уровень боли по ВАШ

Пример 1.

Больная Л., 27 лет. Диагноз при поступлении:

«Ревматоидный артрит, полиартрит, серонегативный, с системными проявлениями (анемия хронического воспаления легкой степени, полинейропатия, ретиноваскулит, вторичный системный остеопороз), активность - I, стадия - III. НФС-II.».

Длительность заболевания 10 лет. В течение года в качестве базисного препарата принимает метотрексат в дозе 10 мг в неделю. При поступлении предъявляет жалобы на боли в мелких суставах кистей, стоп при нагрузке, в покое. Уровень боли по ВАШ 50 мм. Утренняя скованность в течение 1,5 часов.

Объективно: припухлость, болезненность при пальпации пястнофаланговых суставов, плюснефаланговых суставов, проксимальных межфаланговых суставов кистей, ограничение подвижности локтевых суставов за счет боли (число припухших суставов 8, число болезненных суставов 48). HAQ 2.

Данные дополнительных методов обследования:

СОЭ 22 мм/ч, гемоглобин 114 г/л, С-реактивный белок отриц., фибриноген 3,1 г/л.

В дополнение к стандартной базисной терапии проведено 4 введения аутологичных активированных Т-лимфоцитов с интервалом 1 неделя. Переносимость лечения хорошая, побочных явлений не наблюдалось.

Через 1 месяц пациентка отмечала уменьшение времени утренней скованности (60 минут), объективно отмечено уменьшение числа припухших суставов (5), числа болезненных суставов (28).

Данные дополнительных методов обследования:

СОЭ 14 мм/ч, гемоглобин 118 г/л, С-реактивный белок 18 мг/л, фибриноген 3,3 г/л.

Далее продолжено введение аутологичных активированных Т-клеток с интервалом 1 месяц.

Через 6 месяцев отмечено уменьшение уровня боли по ВАШ 40 мм, числа припухших суставов (6), числа болезненных суставов (3). Пациентка полностью соответствовала критериям эффективности ACR 20% (ЧБС - ACR20, ЧПС - ACR20, СОЭ - ACR20, Общая оценка активности болезни по ВАШ - ACR50, уровень боли по ВАШ - ACR20, HAQ - ACR20).

Данные дополнительных методов обследования:

СОЭ 12 мм/ч, гемоглобин 130 г/л, С-реактивный белок отриц., фибриноген 2,2 г/л.

Пример 2.

Больная М., 54 года. Диагноз при поступлении:

«Ревматоидный артрит, полиартрит, серопозитивный, с системными проявлениями (лихорадка, полинейропатия, анемия хронического воспаления легкой степени, лимфоаденопатия, вторичный системный остеопороз), активность - II, стадия - III, НФС - II.

Длительность заболевания 6 лет. В течение 6 месяцев прием базисного препарата - метотрексат 10 мг в неделю. При поступлении предъявляет жалобы на боли воспалительного характера в мелких суставах кистей, стоп, коленных, голеностопных суставах. Утренняя скованность в течение дня. Уровень боли по ВАШ 35 мм.

Объективно: припухлость, болезненность при пальпации коленных, голеностопных суставов, резкая болезненность при пальпации пястнофалагновых, проксимальных межфаланговых суставов II, III пальцев кистей (число припухших суставов 18, число болезненных суставов 23). HAQ 1,5.

Данные дополнительных методов обследования:

СОЭ 52 мм/ч, гемоглобин 111 г/л, С-реактивный белок 36 мг/л, фибриноген 4,4 г/л.

В дополнение к стандартной базисной терапии проведено 4 введения аутологичных активированных Т-лимфоцитов с интервалом 1 неделя. Переносимость лечения хорошая, побочных явлений не наблюдалось.

Через 1 месяц пациентка отмечала уменьшение времени утренней скованности (2 часа). HAQ 1,375. Пациентка полностью соответствовала критериям эффективности ACR 20% (ЧБС - ACR50, ЧПС - ACR70, СОЭ - ACR20, Общая оценка активности болезни по ВАШ - ACR70, уровень боли по ВАШ - ACR70, HAQ - ACR20).

Данные дополнительных методов обследования:

СОЭ 23 мм/ч, гемоглобин 115 г/л, С-реактивный белок 30 мг/л, фибриноген 4,4 г/л.

Далее продолжено введение аутологичных активированных Т-клеток с интервалом 1 месяц.

Через 3 месяца отмечено уменьшение уровня боли по ВАШ 20 мм, числа припухших суставов (19), числа болезненных суставов (26). Пациентка полностью соответствовала критериям эффективности ACR 20% (ЧБС - ACR50, ЧПС - ACR20, СОЭ - ACR50, Общая оценка активности болезни по ВАШ - ACR20, уровень боли по ВАШ - ACR20, HAQ - ACR50).

Данные дополнительных методов обследования:

СОЭ 31 мм/ч, гемоглобин 113 г/л, С-реактивный белок 60 мг/л, фибриноген 3,3 г/л.

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, ревматологии, и касается лечения ревматоидного артрита. Для этого используют аутологичные Т-лимфоциты, активированные с помощью анти CD3 антител и интерлейкина-2. Активированные Т-лимфоциты вводят подкожно 1 раз в неделю в течение 4-х недель и далее 1 раз в месяц в течение одного года. Одновременно проводят стандартную терапию цитостатическими препаратами. Изобретение позволяет снизить клинические проявления заболевания за счет воздействия на измененный иммунный ответ через индукцию антиэрготипического ответа. 2 табл.

Способ лечения ревматоидного артрита с применением вакцинации аутологичными Т-клетками, отличающийся тем, что используют Т-лимфоциты, полученные из периферической крови и активированные с помощью анти CD3 антител и интерлейкина-2 (ИЛ-2), которые вводят больному подкожно 1 раз в неделю в течение 4 недель, затем 1 раз в месяц в течение 1 года на фоне стандартной терапии цитостатическими препаратами.