СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ МИАСТЕНИИ Российский патент 1997 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, а именно к иммуноневрологии.

Известен способ диагностики миастении путем введения больному раствора прозерина с последующим исследованием эффекта его воздействия, заключающийся в том, что исследует кровь до и после введения раствора прозерина, выделяя лейкоциты, соединяя их с 0,1- 0,2 мл 5-й суспензии эритроцитов барана, нагруженных ацетилхолином, инкубируя смесь при температуре 37^o- 37,5^oC с последующим просчетом в мазке розеткообразующих лимфоцитов, и при снижении их исходного числа в 2 и более раз диагностируют миастению.

Недостатком способа являются: техническая сложность его постановки, необходимость парентерального введения медикамента и связанная с этим опасность занесения инфекции, необходимость наличия большого количества одноразовых шприцов, возможность аллергической реакции больного на введение лекарства, необходимость введения дорогого и труднодоступного препарата - прозерина.

Цель изобретения упрощение и удешевление способа диагностики миастении при высокой точности и специфичности.

Цель достигается путем определения в крови больного числа розеткообразующих лимфоцитов, специфичных ацетилхолину. Новым в способе является то, что исследуют исходную кровь больного путем добавления к лейкоцитам пробы крови 0,1- 0,2 мл 0,5-й суспензии эритроцитов барана, нагруженных ацетилхолином, инкубируют смесь при температуре 37^o- 37,5^oC с последующим подсчетом в мазке розеткообразующих лимфоцитов. При наличии в нем числа розеткообразующих клеток (РОК), равном или более 18% диагностируют миастению.

Способ осуществляют следующим образом.

Из вены забирают кровь в количестве 1-1,5 мл в центрифужную пробирку, содержащую такое же количество 5-го раствора цитрата натрия. Смесь перемешивают и после отстаивания забирают взвесь, содержащую 2•10⁶ лейкоцитов. Для лизиса эритроцитов в пробирку добавляют 3 мл дистиллированной воды, перемешивают смесь путем покатывания пробирки между ладонями. Через 20-30 с добавляют 3 мл 1,8-го раствора хлорида натрия, после чего смесь центрифугируют 5 мин при 1500 об/мин. Недостаточную жидкость сливают, к осадку добавляют 1 мл среды 199 и инкубируют при температуре 37^o-37,5^oC в течение 15 мин.

После инкубации смесь центрифугируют 5 мин. Затем удаляют недостаточную жидкость и добавляют 0,1 мл среды 199, ресуспендируют осадок. Затем взвесь выдерживают при комнатной температуре 30 мин, после чего добавляют к ней 0,1 мл 0,5-го раствора ацетил-холинового диагностикума, тщательно перемешивают и инкубируют 15 мин при температуре 37^o-37,5^oC, а затем в течение 18 ч в условиях холодильника. После инкубации взвесь центрифугируют 5 мин при 1500 об/мин, сливают надосадочную жидкость. К осадку добавляют 1 каплю 0,5-го раствора глютарового альдегида, после чего взвесь выдерживают 20 мин при комнатной температуре, затем добавляют 0,75 мл дистиллированной воды и центрифугируют 5 мин при 1500 об/мин. Надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 0,5 мл 5-го раствора бычьей сыворотки, после чего вновь центрифугируют. Из осадка готовят мазок, высушивают его на воздухе, фиксируют этиловым спиртом в течение 30 мин и окрашивают по Романовскому-Гимзе. Считают под микроскопом при 900-кратном увеличении 100 лимфоцитов, отмечают среди них число (в) клеток, фиксировавших на своей поверхности 3 и более бараньих эритроцита (РОК), и при числе РОК, равном или более 18, определяют миастению.

Для доказательства специфичности розеткообразования используют реакцию торможения розеткообразования. С этой целью готовят исходный раствор ацетилхолина, содержащий 1 мг вещества в 1 мл среды 199. Из исходного раствора берут 0,1 мл, соединяют с 0,3 мл среды 199. Суспензию лимфоцитов больного в объеме 0,4 мл, содержащую 2 • 10⁶ клеток, соединяют с равным количеством раствора ацетилхолина (250 мкг/мл) и выдерживают 30 мин при температуре 37^o- 37,5^oC. Затем клетки отмывают фосфатным буферным раствором pH 7,2, после чего реакцию розеткообразования ставят по вышеописанной методике.

Эритроцитарный ацетилхолиновый диагностикум готовят по следующей методике: свежие эритроциты барана трижды отмывают изотоническим раствором натрия хлорида pH 7,2, центрифугируют взвесь в течение 5 мин при 1500 об/мин. Из отмытых эритроцитов готовят 5-ю взвесь, соединяя 0,5 мл осадка эритроцитов и 9,5 мл забуференного изотонического раствора натрия хлорида pH 7,2. При глутаризации смешивают 5-ю взвесь эритроцитов с 0,25-м свежеприготовленным раствором глутарового альдегида в соотношении 1:1. Выдерживают смесь при 37^o-37,5^oC в течение 15 мин, после чего эритроциты тщательно отмывают от глутарового альдегида забуференным изотоническим раствором натрия хлорида pH 7,2 и этим же раствором доводят объем до первоначального (5-я взвесь). Приготовленные таким образом эритроциты хранят при 4^oC в течение 6 мес.

Для сенсибилизации эритроцитов ацетилхолином 1 мл 5-го раствора глютаровых эритроцитов дважды отмывают фосфатным буферным раствором pH 6,4. К осадку глютаровых эритроцитов добавляют 1 мл раствора ацетилхолина (200 мг сухого вещества, растворенного в 1 мл фосфатного буферного раствора pH 6,4). Смесь перемешивают, инкубируют при температуре 37^oC 30 мин, периодически встряхивая. Затем дважды отмывают в 5 мл фосфатного буферного раствора pH 7,2, после чего взвесь доводят до первоначального объема этим же буферным раствором. Диагностикум разводят до 0,5-го раствора средой 199.

Результаты проведенных исследований приведены в табл. 1-5.

Результаты осуществления предлагаемого способа с инкубацией индикаторной системы в течение 30 и 60 минут, при температуре +37^oC и +37,5^oC приведены в табл. 5.

Пример 1. Больной К. 52 лет, болен с августа 1994 г. когда после стресса постепенно появилось двоение и опустилось правое веко. Обратился к офтальмологу, диагноз поставлен не был. В декабре 1995 г. обследован в клинике нервных болезней ОКБ г. Перми. В неврологическом статусе: диплопия, птоз справа, конвергенция ослаблена с двух сторон. Клинический диагноз: Миастения. Глазная форма. Примененная с диагностической целью классическая прозериновая проба дала отрицательный результат. Предлагаемым способом было проведено иммунологическое исследование крови больного, для чего к лейкоцитам исходной крови больного добавляли 0,1 мл 0,5-й суспензии эритроцитов барана, нагруженных ацетилхолином, после чего смесь инкубировали при температуре 37^oC. При подсчете в мазке розеткообразующих лимфоцитов их число составило 18% Таким образом, с помощью предлагаемого способа иммунологически подтвержден клинический диагноз миастении.

Пример 2. Больная А. 56 лет, заболела в марте 1993 г. после гриппа и эмоционального перенапряжения. На фоне полного здоровья опустилось левое веко. Птоз был не постоянным, и больная к врачу не обращалась. В августе 1995 г. присоединилось двоение, птоз стал двусторонним, появилась слабость в руках и ногах, больная стала испытывать затруднение при глотании. Был диагностирован ишемический инсульт в вертебро-базиллярном бассейне. Проведение лечение эффекта не дало. В декабре 1995 г. больная поступила в клинику нервных болезней, где высказано мнение о миастении. Неврологически определялись диплопия, расходящийся стробизм справа, двусторонний птоз, речь с носовым оттенком, сила в кистях снижена до 3 баллов. Диагностирована меастения, генерализованная форма. Было проведено иммунологические исследования крови больной: лейкоциты исходной крови больной соединяли с 0,2 мл 0,5-й суспензии эритроцитов барана, нагруженных ацетилхолином, смесь инкубировали при 37,5^oC, затем подсчитывали в мазке число РОК, которое составило 70 Предлагаемым способом иммунологически подтвержден клинический диагноз миастении.

Пример 3. Больная К. 67 лет. Считает себя больной с 40-летнего возраста, когда впервые появилась быстрая утомляемость. Год назад после сильного стресса стали опускаться веки, иногда до полного смыкания, начала испытывать затруднение при разговоре. Обратилась к неврологу по месту жительства 6 мес назад, диагностирована миастения, главная форма. Классическая диагностическая прозериновая проба отрицательна. С момента постановки диагноза постоянно принимала калимин по 4-5 таблеток в сут, но без эффекта. Поступила в неврологическое отделение МСЧ N 5 г. Перми с жалобами на общую слабость, смыкание век, утомляемость жевательных мышц при жевании и разговоре. Неврологически определяется двустороннее, периодически возникающее смыкание век, недостаточность конвергенции слева, парез VII и XII пар черепных нервов слева центрального характера. Клинический диагноз: миастения, главная форма. Предлагаемым способом проведено иммунологическое исследование крови больной и установлено наличие в исходной крови больной 5 РОК. В иммунной реакции диагноз миастении не подтвердился. При дальнейшем клиническом наблюдении диагноз миастении у больной был отвергнут. Поставлен диагноз: астенический невроз с миастеноподобным синдромом.

Пример 4. Больной Я. 38 лет, поступил в клинику нервных болезней с жалобами на боли в пояснице с иррадиацией по наружной поверхности левого бедра и голени, онемение наружного края левой стопы. Боли усиливаются при движении. Болен 3 года, обострения бывают 1-2 раза в год. Последнее возникло за месяц до поступления в клинику. При обследовании отмечен вертебральный синдром в виде ограничения объема движений в поясничном отделе позвоночника, резкой сглаженности поясничного лордоза, левостороннего сколиоза, дефанса мышц поясницы. Определялся положительный симптом Ласега с двух сторон, больше слева, гипестезия по наружной поверхности левой голени. Коленные рефлексы живые, равные. Правый ахиллов рефлекс снижен, левый не вызывается. На рентгенограмме: косвенных признаки грыжи диска L4. Клинический диагноз: Остеохондроз поясничного отдела позвоночника, грыжа диска L4, компрессионный корешковый синдром. При иммунологическом исследовании крови предлагаемым способом число Ах-РОК в исходной крови больного составило 6 Иммунная реакция для миастении не характерна.

Пример 5. Донор Е. (женщина), 30 лет, практически здорова. При иммунологическом исследовании крови заявляемым способом число Ах-РОК в исходной крови составило 3 Иммунная реакция для миастении не характерна.

Преимущества предлагаемого способа заключаются в его технической простоте, отсутствии необходимости введения больным медикаментов, связанного с опасностью внесения инфекции или возникновения аллергического побочного действия у пациента, отсутствии необходимости иметь одноразовые шприцы.

Способ обеспечивает чувствительную и специфичную иммунодиагностику миастении. Способ позволяет рано диагностировать дебюты заболевания, его стертые и атипичные формы, дает возможность дифференциальной диагностики в неясных, сомнительных случаях.

Использование: в медицине, в частности, в иммуноневрологии. Технический результат: упрощение способа при его высоте точности и специфичности. Сущность: цель достигается путем определения в крови больного числа розеткообразующих лимфоцитов, специфичных ацетилхолину. Новым в способе является то, что исследует исходную кровь больного путем добавления к лейкоцитам пробы крови 0,1-0,2 мл 0,5% суспензии эритроцитов барана, нагруженных ацетилхолином, инкубируют смесь при 37^o-37,5^oC с последующим подсчетом резоткообразующих лимфоцитов в мазке. При наличии в нем числа розектообразующих клеток (РОК), равном или более 18%, диагностируют миастению. 5 табл.

Способ диагностики миастении путем определения в крови больного числа розеткообразующих клеток, специфичных ацетилхолину, отличающийся тем, что к лейкоцитам исходной крови больного добавляют 0,1 0,2 мл 5%-ной суспензии эритроцитов барана, нагруженных ацетилхолином, инкубируют смесь при 37 - 37,5^oС с последующим подсчетом в мазке розеткообразующих лимфоцитов и при наличии в ней числа розеткообразующих клеток, равном или более 18% диагностируют миастению.