СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ РАССЕЯННОГО СКЛЕРОЗА Российский патент 1997 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике рассеянного склероза (РС).

Известен способ диагностики РС, заключающийся в том, что лимфоциты крови больного, взятые после введения ему раствора серотонина, соединяют в геле с эритроцитами барана, сенсибилизированными серотонином и при постоянном числе зон лизиса эритроцитов 10⁶ 10⁷ на мл диагностируют РС (см. Патент РФ N 2007714, кл. G 01 N 33/48; 1994). Недостатками способа являются техническая сложность его постановки, необходимость специальной аппаратуры и обученного персонала.

Цель изобретения упрощение способа диагностики заболевания РС при высокой точности и специфичности.

Эта цель достигается за счет определения в сыворотке крови больных противосеротониновых гемагглютинирующих антител.

Существенные признаки предлагаемого способа.

Ограничительные: больному вводят 0,5 мл 0,1 раствора серотонина, берут кровь из вены до и через 30 мин после введения серотонина.

Отличительные: 0,1 0,2 мл сыворотки крови больного в разведениях, кратных 2, соединяют с эритроцитами барана, обработанными серотонином, смесь выдерживают при температуре 37 37,5^oC в течение 50 60 мин и при температуре 4^oC в течение 18 20 ч и при постоянном титре гемагглютинирующих антител по сравнению с исходным диагностируют рассеянный склероз.

Способ осуществляют следующим образом: исследуемую сыворотку крови человека освобождают от гетерофильных антител к форсмановскому антигену поверхности эритроцитов барана путем двукратной адсорбции сыворотки осадком отмытых бараньих эритроцитов. С этой целью к 1 мл сыворотки добавляют 0,1 мл уплотненного осадка эритроцитов, перемешивают и инкубируют в течение 20 мин при комнатной температуре. После инкубации эритроциты осаждают центрифугированием при 1500 об/мин в течение 5 мин. Сыворотку переносят в чистую пробирку и добавляют 0,1 мл уплотненного осадка эритроцитов, повторяя процедуру адсорбции. Адсорбированную сыворотку инактивируют при температуре 56^oC в течение 30 мин. Эритроциты барана обработанные глютаровым альдегидом и сенсибилизированные серотонином, используемые в реакции, готовят как описано ниже. В реакции применяют 2,5 взвесь их. При постановке реакции готовят ряд разведений опытной и ряд разведений контрольной (донорская, сыворотка больного другим заболеванием нервной системы) сывороток, кратных 2. В качестве разбавителя исследуемых сывороток и сенсибилизированных эритроцитов используют нормальную кроличью сыворотку, истощенную эритроцитами барана, декомплементированную при температуре 56^oC в течение 30 мин и разведенную фосфатным буферным раствором 1 250. Постановку реакции осуществляют в плашках для иммунологических реакций однократного пользования. Реакцию ставят в объеме сыворотки 0,1 0,2 мл. В оба ряда разведений сывороток пастеровской пипеткой вносят сенсибилизированные серотонином эритроциты в объеме 0,05 мл. Нормальную кроличью сыворотку, используемую в качестве разбавителя, проверяют на возможность спонтанной агглютинации, добавляя к ней те же эритроциты. Реакция учитывается в случае отсутствия агглютинации в этом контроле. По окончании постановки реакции планшеты осторожно встряхивают, закрывают крышками и инкубируют при температуре 37 37,5^oC в течение 50 60 мин, а затем при температуре 4^oC в течение 18 20 ч. Учитывают реакцию визуально: неагглютинорованные эритроциты осаждаются в виде плотного темно-коричневого кружка в центре лунки ("пуговица"). При агглютинации осадок разбит и неровен. При выраженной реакции осадок распределяется на отдельные гранулы ("кружево"). При слабой реакции определяется круг или кольцо с неровными зазубренными краями. Последнее разведение сыворотки, при котором наблюдается агглютинация, принимается за ее титр. Если титр гемагглютинорующих антител не изменился по сравнению с исходным, то определяют заболевание - рассеянный склероз.

Для доказательства специфичности реакции используют адсорбцию антител из исследуемой сыворотки с помощью эритроцитов, сенсибилизированных серотонином, или торможение реакции предварительной обработкой исследуемой сыворотки избытком серотонина. Адсорбцию сыворотки проводят следующим образом: 1 мл 5 взвеси сенсибилизированных серотонином эритроцитов центрифугируют при 1500 об/мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость отсасывают, а на оставшийся плотный осадок эритроцитов наслаивают 1 мл исследуемой сыворотки. Смесь тщательно перемешивают встряхиванием и инкубируют при температуре 37^oC в течение 30 мин. После инкубации смесь центрифугируют, сыворотку отсасывают и наслаивают повторно на осадок сенсибилизированных эритроцитов в другой пробирке и процедуру истощения сыворотки повторяют. После двойной адсорбции сыворотку используют в реакции. Торможение РПГА ставят, внося в 1 мл подготовленной для реакции исследуемой сыворотки 1 мг серотонина. Смесь инкубируют при температуре 37^oC в течение 30 мин, после чего ставят реакцию пассивной гемагглютинации.

Приготовление эритроцитарного диагностикума.

Свежие эритроциты барана трижды отмывают изотоническим раствором хлорида натрия (pH 7,2), центрифугируя взвесь в течение 10 мин при 1500 об/мин. Из отмытых эритроцитов готовят 5 взвесь, соединяя 0,5 мл осадка эритроцитов и 9,5 мл забуференного изотонического раствора хлорида натрия pH 7,2. При глютаризации смешивают 5 взвесь эритроцитов с 0,25 свежеприготовленным раствором глютарового альдегида при соотношении 1 1. Смесь выдерживают при температуре 37^oC в течение 15 мин, после чего эритроциты тщательно отмывают от глютарового альдегида забуференным изотоническим раствором хлорида натрия pH 7,2 и доводят этим же раствором до первоначального объема (5 взвесь). Приготовленные таким образом эритроциты хранят при температуре 4^oC.

Для сенсибилизации эритроцитов готовят раствор серотонина, растворяя 1 мг его в 10 мл забуференного изотонического раствора хлорида натрия pH 6,4, эритроциты отмывают изотоническим раствором хлорида натрия pH 6,4 и доводя им же взвесь до первоначального объема, затем соединяют с раствором серотонина при соотношении 1 1. Смесь оставляют при комнатной температуре в течение 20 мин, после чего дважды отмывают забуференным раствором хлорида натрия pH 7,2. Используют в реакции пассивной гемааглютинации 2,5 взвесь сенсибилизированных серотонином эритроцитов.

Результаты проведенных исследований приведены в табл. 1 3.

Результаты осуществления предлагаемого способа с использованием 0,1 и 0,2 мл сыворотки крови, инкубации индикаторной системы в течение 50 и 60 мин при температуре 37^oC и 37,5^oC приведены в табл. 4.

Примеры практического применения.

Пример 1. Больная З. 37 лет, инвалид II группы, повторно поступила в клинику нервных болезней 1 февраля 1989 года с жалобами: слабость в ногах, пошатывание при ходьбе, головокружение, двоение, снижение зрения, периодическое нарушение функций тазовых органов. Из анамнеза известно, что больна с 1978 года, течение заболевания ремиттирующее, обострения отмечались в 1982, 1985, 1987 годах. При осмотре отмечено: патологии со стороны внутренних органов нет. Пульс 68 уд./мин, артериальное давление 120/80 мм рт. ст. Неврологически: горизонтальный нистагм в обе стороны, речь дизартрична. Спастический тетрапарез с патологическими рефлексами. Выраженная статическая и динамическая атаксия. Анализ мочи и крови без патологии. На обзорной краниограмме изменений нет. Глазное дно: деколорация височных половин дисков зрительных нервов. Установлен диагноз: рассеянный склероз, цереброспинальная форма.

У больной до и через 30 мин после подкожного введения 0,5 мл 0,1 раствора серотонина взяли кровь из вены, получили сыворотку крови, соединили 0,1 мл сыворотки в разведениях, кратных 2, с эритроцитами барана, обработанных серотонином. Смесь выдержали при температуре 37^oC в течение 60 мин и при температуре 4^oC в течение 18 ч. Через 18 ч определили титр противосеротониновых антител в сыворотке.

Заключение: титр антител в ответ на введение серотонина в крови больной не изменился (1 2 до введения серотонина и 1 2 после). Тем самым подтвержден иммунологически клинический диагноз рассеянного склероза.

Пример 2. Больная Л. 35 лет, воспитатель детского сада. Поступила в клинику 18 января 1989 года с жалобами на слабость в ногах, пошатывание при ходьбе, головокружение, снижение зрения. Больна в течение полугода, когда стала отмечать нарастающую слабость в ногах, пошатывание. При осмотре патологии со стороны внутренних органов не выявлено. Пульс 75 уд./мин, артериальное давление 130/85 мм рт. ст. Неврологически: эйфория, горизонтальный нистагм в обе стороны. Спастический тетрапарез с патологическими рефлексами. Интенционный тремор с двух сторон. Неустойчива в позе Ромберга. На краниограмме патологии нет. Глазное дно без изменений. Установлен диагноз: дебют рассеянного склероза, цереброспинальная форма.

Больной ввели подкожно 0,5 мл 0,1 раствора серотонина, взяли кровь из вены, получили сыворотку крови, соединили 0,2 мл сыворотки в разведениях, кратных 2, с эритроцитами барабана, сенсибилизированными серотонином. Смесь выдержали при температуре 37,5^oC в течение 50 мин и при температуре 4^oC в течение 20 ч. Через 20 ч определили титр противосеротониновых антител в сыворотке.

Заключение: титр антител в ответ на введение серотонина в крови больной не изменился. Эти данные позволили поставить диагноз дебюта рассеянного склероза.

Пример 3. Больная К. 35 лет, маляр. Поступила в клинику неврологии 26 августа 1989 года с жалобами на боли в пояснично-крестцовой области с иррадиацией в левую ногу. При осмотре отмечено: сглажен поясничный лордоз, дефанс мышц спины, положительный симптом Ласега справа, гипостезия по наружной поверхности правой голени. Правый ахиллов рефлекс не вызывается. На спондилограмме снижен диск между 4 5 поясничными позвонками, выраженный сколиоз. Диагноз: остеохандроз пояснично-крестцового отдела позвоночника, грыжа диска, компрессия пятого поясничного корешка справа.

Больной ввели подкожно 0,5 мл 0,1 раствора серотонина, взяли кровь из вены, получили сыворотку крови. Соединили сыворотку в разведениях, кратных 2, с эритроцитами барабана, сенсибилизированными серотонином. Смесь выдержали при температуре 37^oC в течение 50 мин и при температуре 4^oC в течение 20 ч. Через 20 ч определили титр антител к серотонину в сыворотке крови.

Заключение: титр противосеротониновых антител в ответ на введение серотонина возрос с 1 8 до 1 128 (в 16 раз) по сравнению с исходным. Заболевание рассеянным склерозом исключается.

Пример 4. Донор А. 30 лет, практически здорова.

У донора до и после 30 мин после подкожного введения 0,5 мл 0,1 раствора серотонина взяли кровь, получили сыворотку крови, соединили ее в разведениях, кратных 2, с эритроцитами барабана, сенсибилизированными серотонином. Смесь выдержали при температуре 37^oC в течение 60 мин и при температуре 4^oC в течение 18 ч. Через 18 ч определили титр противосеротониновых антител в сыворотке.

Заключение: титр антител, специфичных серотонину, возрос в крови обследуемой с 1 16 до 1 128 (в 8 раз) по сравнению с исходным. Заболевание рассеянным склерозом исключается.

Преимущества предлагаемого способа заключаются в его технической простоте, отсутствии необходимости для исполнения сложной аппаратуры, дорогостоящих реактивов, специально обученного персонала. Способ обладает высокой точностью и специфичностью.

Использование: в медицине, для диагностики рассеянного склероза. Сущность изобретения: у больного из вены берут кровь до и через 30 мин после подкожного введения ему 0,5 мл 0,1 % раствора серотонина, сыворотку крови больного в разведениях, кратных 2, соединяют с эритроцитами барана, обработанными серотонином, смесь выдерживают при температуре 37 - 37,5^oC в течение 50 - 60 мин и при температуре 4^oC в течение 18 - 20 ч. Оценивают титр гемагглютинирующих антител и, если он не изменился после введения серотонина, диагностируют рассеянный склероз. Способ позволяет упростить диагностику заболевания. 4 табл.

Способ диагностики рассеянного склероза путем взятия крови из вены больного до и через 30 мин после подкожного введения ему 0,5 мл 0,1%-ного раствора серотонина, соединения пробы биологического материала с эритроцитами барана, нагруженными серотонином, выдерживания полученной смеси при 37 - 37,5^oС с последующей оценкой результатов реакции, отличающийся тем, что в качестве пробы биологического материала используют сыворотку крови больного в разведениях, кратных 2, смесь при 37 37,5^oС выдерживают 50 60 мин и дополнительно при 4^oС в течение 18 20 ч, затем оценивают титр гемагглютинирующих антител и, если он не изменился после введения серотонина, диагностируют рассеянный склероз.