СПОСОБ ГИСТОХИМИЧЕСКОГО ВЫЯВЛЕНИЯ МЕЛАТОНИНА Российский патент 1997 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к области медицины и биологии и может быть использовано для цитологического и гистологического анализа закономерностей строения и функции клеток паренхимы пинеальной железы /эпифиза/, а также одиночных гормонопродуцирующих клеток диффузной эндокринной системы.

Известны флюоресцентные способы внутриклеточного выявления биогенных аминов:
1/ по Эренке путем замораживания свежих кусочков тканей, приготовления криостатных срезов толщиной 50 мкм, их оттаивания на поверхности раствора, содержащего 1 объем 40%-ного раствора формалина, 5 объемов 2%-ного раствора CaCl₂ и 4 объема дистиллированной воды, споласкивания срезов через 2 - 6 ч в дистиллированной воде, помещения на стекла, заключения в глицерин и исследования на флюоресцентном микроскопе /Пирс Э. 1962/ [1]
2/ по Бьерклунду с соавт. путем конденсации с глиоксиловой кислотой, при которой кусочки быстро извлеченной ткани помещают в холодный буфер, срезы, приготовленные на вибротоме, толщиной 20 -50 мкм, перенесенные на предметные стекла, 15 мин высушивают в токе теплого воздуха, помещают на ночь в эксикатор с P₂O₅ под вакуумом, после чего в реакционный сосуд сначала впускают нагретый до 100^oC воздух, насыщенный парами глиоксиловой кислоты, предварительно в течение суток высушиваемый над P₂O₅, затем теплый воздух /100^oC/ до нормализации атмосферного давления, заключают срезы в жидкий парафин и исследуют на флюоресцентном микроскопе /Луппа Х. 1980/ [2]
Данные способы не позволяют выявить с достаточной интенсивностью и специфичностью флюоресценцию ацетилированных индоламинов, к которым относится мелатонин. Кроме того, способ конденсации отличается значительной трудоемкостью и требует сложного оборудования.

Наиболее близким предлагаемым методом /прототипом/ является способ гистохимического выявления биогенных аминов путем замораживания быстро извлекаемых кусочков тканей на охлажденном до -30^oC блок-держателе криостата, приготовления криостатных срезов толщиной 15 30 мкм, их помещения на предметные стекла, погружения на 3 с в раствор сахарозы /10,2 г/, гидрофосфата калия /4,2 г/ и кристаллической глиоксиловой кислоты /1,5 г/ в дистиллированной воде /доводят объем до 150 мл, pH 7,4/, высушивают в струе воздуха /до 30 мин/ с последующим нанесением светлого минерального масла и помещением срезов на 2,5 3,0 мин в сушильный шкаф при температуре 95^oC, заключением под покровные стекла и исследованием в флюоресцентном микроскопе /Буреш Я. с соавт. 1991/ [3]
Прототип не лишен недостатков: в нейтральной или слабощелочной среде с глиоксиловой кислотой, в которую погружают срезы, флюоресценцию приобретают не только мелатонин, но и другие индольные производные /Левин И.М. с соавт. 1988/ [4]
Задачей предлагаемого изобретения является выявление с высокой долей специфичности внутриклеточного мелатонина.

Поставленная цель достигается путем замораживания кусочков быстро извлеченных тканей на блок-держателе криостата, охлажденном до -30^oC, приготовления криостатных срезов толщиной 15 20 мкм, помещения их на покровные стекла, погружения срезов на 5 -10 мин в 0,4 0,5%-ный раствор ортофталевого альдегида в 0,1 н HCl на кипящей водяной бане, высушивания в струе воздуха /15 мин/, заключения в светлое минеральное масло и исследования в флюоресцентный микроскоп.

Новым в предлагаемом изобретении является то, что криостатные срезы погружают на 5 10 мин в реакционную смесь, представляющую собой 0,4 - 0,5%-ный раствор ортофталевого альдегида в 0,1 н HCl на кипящей водяной бане.

В проанализированной автором литературе не найдено данной совокупности существенных признаков, поэтому предлагаемый способ соответствует критериям изобретения "новизна" и "изобретательский уровень".

Данный способ гистохимического выявления мелатонина может успешно использоваться для разработки морфологических тестов при оценке морфофункционального состояния как одиночных гормонопродуцирующих клеток диффузной эндокринной системы, так и секретирующих мелатонин пинеалоцитов шишковидной железы /эпифиза/, играющей важную роль в регуляции суточных ритмов и в адаптации организма к воздействиям неблагоприятных факторов.

Таким образом, способ гистохимического выявления мелатонина соответствует критерию изобретения "промышленно применимо".

Способ осуществляют следующим образом: быстро извлеченные кусочки свежих тканей замораживают до -30^oC на охлажденном блок-держателе криостата, приготавливают криостатные срезы толщиной 15 20 мкм, помещают их на покровные стекла, погружают на 5 10 мин в 0,4 0,5%-ный раствор ортофталевого альдегида в 0,1 н HCl на кипящей водяной бане, высушивают срезы 15 мин в струе воздуха, заключают в светлое минеральное масло и исследуют в флюоресцентном микроскопе.

Конкретные примеры выполнения.

1. Животное /крысу/ декапитируют, вскрывают черепную коробку /по периметру/, извлекают пинеальную железу /эпифиз/, помещают ее на охлажденный до -30^oC блок-держатель криостата, приготавливают криостатные срезы толщиной 15 мкм, помещают их на покровные стекла, расправляя пальцем, погружают срезы на стеклах с держателями, изготовленными из спичек, в стаканчик с 0,4%-ным раствором ортофталевого альдегида в 0,1 н HCl на кипящей водяной бане, извлекают через 5 мин из реакционной среды, укрепляют держателями в пластилине, обсушивают 15 мин феном, капают нагретое светлое минеральное масло на предметные стекла, снимают держатели с покровных стекол, заключают срезы и исследуют их флюоресценцию голубого цвета в микроскоп ЛЮМАМ-ИЗ с светофильтром возбуждения УФС 6, запирающими светофильтрами ЖС 3 и БС 8, областью пропускания 420 500 нм. Пинеалоциты на срезах эпифизов контрольных животных дают яркую флюоресценцию. После прекращения 48- часового светового воздействия на крыс освещенностью 3500 лк интенсивность флюоресценции пинеалоцитов, особенно на периферии долек шишковидной железы, существенно ослабевает, что свидетельствует о снижении содержания в них мелатонина.

2. Животных /крыс/ декапитируют, быстро извлекают подчелюстные железы, блоки желез толщиной 5 мм помещают на охлажденный до -30^oC блок-держатель криостата, приготавливают криостатные срезы толщиной 15 мкм, помещают их на покровные стекла с держателями, расправляя прикосновением пальца, погружают срезы в 0,5%-ный раствор ортофталевого альдегида в 0,1 н HCl на кипящей водяной бане, через 10 мин извлекают, обсушивают 15 мин феном, капают нагретое светлое минеральное масло на предметные стекла, снимают держатели с покровных стекол, заключают срезы и исследуют их флюоресценцию голубого цвета в микроскоп ЛЮМАМ-ИЗ с светофильтром возбуждения УФС 6, запирающими светофильтрами ЖС 3 и БС 8, областью пропускания 420 500 нм. Продукт взаимодействия ортофталевого альдегида с мелатонином в цитоплазме клеток эпителия гранулярных (извитых) отделов исчерченных выводных протоков подчелюстных желез контрольных крыс дает сильную флуоресценцию, заметно выделяя названные структуры. После 48-часового светового воздействия на крыс освещенностью 3500 лк интенсивность флюоресценции клеток извитых протоков ослабевает.

Способ гистохимического выявления мелатонина по сравнению с имеющимися, в том числе и с прототипом, отличается более высокой специфичностью и меньшей трудоемкостью, поскольку авторы предложили использовать для внутриклеточного выявления мелатонина погружение криостатных срезов тканей в 0,4 0,5% -ный раствор ортофталевого альдегида в 0,1 н HCl на кипящей бане, причем оптимальная концентрация ортофталевого альдегида, температура и время реакции были определены экспериментально.

Концентрация ортофталевого альдегида в растворе меньше 0,4% не позволяет выявлять внутриклеточный мелатонин на срезах с достаточным постоянством, после погружения срезов в реакционный раствор значительно меньшей концентрации ортофталевого альдегида он не выявляется. Раствор с концентрацией выше 0,5% может оказать нежелательное действие на структуру клеток и тканей. Нейтральная или слабощелочная реакционная среда не подавляет флюоресценцию многих индольных производных, затрудняя исследование в микроскоп ЛЮМАМ содержание внутриклеточного мелатонина по интенсивности флюоресценции голубого цвета в области пропускания 420 500 нм (для мелатонина максимум возбуждения 365 нм, максимум флюоресценции 470 нм). В слабокислой среде из всех индоламинов сохраняет интенсивную флюоресценцию только мелатонин. Более кислые, чем 0,1 н. HCl реакционные среды существенно снижают интенсивность флюоресценции и оказывают более значительное влияние на структуру клеток и тканей. Мелатонин в воде плохо растворим, поэтому для его внутриклеточного выявления можно использовать метод погружения в реакционную среду, но если время погружения на водяной бане будет меньше 5 мин, в клетках достаточное количество флюоресцирующего продукта взаимодействия мелатонина с ортофталевым альдегидом не образуется. Погружение более чем на 10 мин на кипящей водяной бане небезразлично в отношении сохранения структуры тканей, увеличивает диффузию мелатонина из клеток. При температуре реакционной среды меньшей, чем на кипящей водяной бане, флюоресцирующий продукт взаимодействия мелатонина с ортофталевым альдегидом в количестве, достаточном для его исследования в микроскоп, не образуется. Более высокие температуры оказывают нежелательное действие на ткани.

Литература
1. Пирс Э. Гистохимия. М. ИЛ, 1962, с. 962.

2. Луппа Х. Основы гистохимии. М. Мир, 1980, с. 343.

3. Буреш Я. Бурешова О. Хьюстон Д.П. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения. М. Высшая школа, 1991, с. 399.

4. Левин И. М. Кветной И.М. Громова Н.В. Повышение чувствительности и специфичности флюорометрического определения мелатонина в моче. // Лабораторное дело, 1988, N4, с. 54 57.

Использование: в области медицины и биологии и может быть применено для цитологического и гистологического анализа закономерностей строения и функционирования клеток паренхимы пинеальной железы (эпифиза) и одиночных гормонопродуцирующих клеток диффузной эндокринной системы. Технический результат: выявление с высокой долей специфичности внутриклеточного мелатонина. Сущность: быстро извлеченные кусочки свежих тканей замораживают до -30^oC на охлажденном блок-держателе криостата, приготавливают криостатные срезы толщиной 15-20 мкм, помещают их на покровные стекла, погружают на 5-10 минут в 0,4-0,5% раствор ортофталевого альдегида в 0,1 н HCl на кипящей водяной бане, высушивают срезы 15 мин в струе воздуха, заключают в светлое минеральное масло и исследуют на флюоресцентном микроскопе.

Способ гистохимического выявления мелатонина, заключающийся в замороживании кусочков быстро извлеченных свежих тканей на охлажденном блок-держателе криостата, приготовлении криостатных срезов, помещении их на стекла, погружении в реакционную смесь, высушивании, заключении в светлое минеральное масло и исследовании на флюоресцентном микроскопе, отличающийся тем, что криостатные срезы погружают в 0,4 0,5%-ный раствор ортофталевого альдегида в 0,1 н. HCl на кипящей водяной бане на 5 10 мин.