Способ получения поливалентного панкреатического ингибитора,обладающего антикининогеназным действием Советский патент 1982 года по МПК A61K38/57 C08B37/02 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИВАЛЕНТНОГО ПАНКРЕАТИЧЕСКОГО ИНГИБИТОРА. ОБЛАДАЮЩЕГО АНТИКИНИНОГЕНАЗНЫМ ДЕЙСТВИЕМ

1

Изобретение относится к фармацевтичеокой промышленности, в частности к спо- собу попучения вещества,, обладающего антикининогеназным действием, и может найти применение в медицине.

Молекула поливалентного панкреатичеокогр ингибитора кининогеназ (ППИК), выделенная из-поджелудочной и рколоуиьной желез и легких крупного рогатого скота, состоит из 58 аминокислотных ю остатков. ППИК широко применяется в медицине в качестве лекарственного средства (гордокс) при лечении ряда забол&ваний, сопровождаюишхся избыточным образованием биологически активных поли- ts пептидов - кининов

Недостатком известного средства является К1ютковременное действие, связанное с быстрым выведением его вз организма. Время полувыведения гордокса зависит 20 от дозы и составляет ЗО-7О мин.

Целью изобретения является получение целевого продукта, обладающего длител ной антикининогеназной активностью.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения поливалентного панкреатического ингибитора, обладающего антикининогеназным дейсгвкем, включающему выделение ингибитора из организма крупного рогатого скота, 1-8 вес.ч. поливалентного панкреатического ингибитора дополнительно обрабатывают раствором смеси карбоксц метилдекстрана и 1А-9тил-3-(з-диэтиламинопропил)карбодиимида при их соотношении 2,5-10:5-10 при рН 4,7-7,6 и 20-25°С.;

Следует отметить, что только использование карбоксимётилдекстрана приводит к пролонгированию действия ППИК, другие же полисахарвды, такие как декстран и ДЭАЗ-декстран, приводят к получению продуктов, содержащих 0,2-1% белка в препарате с сохранением менее 1О% и гибирующей активности, тогда как карбо ксиметилдекстран приводит к продукту, содерисащему 2О-50% белка от веса пре, парата с полным сохранением кин латических и равновесных ковстант в модельной реакции ассоциации с трипсином.

Структура нового произвол нотч) ПГШК индивидуального -полимерного продукта, полученного химическим путем аци лированием карбоксиметилдёкстраном. в присутст ВИИ карбодиимида, подтверждена химическими и физико-химическими методами. Образование связи с носителем доказано измерением количества модифицированных аминогрупп ППИК. ,

Реакция с тринитробензолсуль юкислотой показывает, что при ашшировании КМ-дейстраном вступают в реакцию две аминогруппы белка. Выделение препарата ППЙК, связанного с карбоксИметилдёкстраном, проводилось Методом, гель-хроматографии, в основе которого лежит разделение веществ с различньпуги величинами Молекулярных весов. Хроматографически выделенный пик высокомолекулярного веще тва содержит белок, определенный известны методом Лоури, и. полисахарид, определенный по цветной реакции Дюбуа.

Новое производное ППИК сохраняет : биологическую активность - является ингибитором кининогеназ, но в отличие от исходного продукта - ППИК обладает пролонгированным действием, что подтверждено на модели острого панкреат та у собак данными lio выживаемости и средней продолжительности жизни.

Пример 1. 200 мг КМ-декстрана (ст.з. 0,6; средний Mv- б-Ю) растворяют в 1О мл ОД М раствора

хлористого натрия и добавляют 200 мг 1-©ти/1 (3 -диэтиламинопрошш) карбодиимида, рН реакционной смеси поддерживают 4,7 в течение 30 мин. Затем к реакционной смеси добавляют 1ОО мг ППИК, смесь инкубтфуют при рН 5,7 в течение 16-24 ч при , ППИК, связанный с КМ-декстраном, отделяют от нативного белка гель хроматографией реакционной смеси на колонке с сефарозо 6В-С1 (25 V400 мм), уравновешенной 0,1 М раствором хлористого натрия при рН 5,7. За хроматографическим разделением следят по изменению оптической плотности при 23О и 2О6 нм. Первый пик, соответствующий высокомолекулярному производному ППИК, обессоливают ; на колонке с сефадексом G-25 (25 6ОО мм), уравновешенном 5%-ным раотвором уксусной кислоты. Обессоленный препарат лиофильно высушивают и определяют в нем содеркание белка по- мето ду Лоури и ингибирующую активность по отношению к трипсину. Полученное водорастворимое соединение ППИК с КМ-дек. страном содержит ЗО% белка от сухого веса препарата и сохраняет 75% инга

бирующей активности по отношению к

трипсину.

Пример 2. 52 мг КМ-декстрана {ст.з. 0,6; средний Mr 6 10) рас. творяют в 10 мл 0,1 М раствора хлорида натрия и добавляют 200 мг 1-етил-3 (3-диэ тилами нопропил) карбодиимида, рН реакционной смеси поддерживают 5,7 в течение 30 мин. Затем к реакционной смеси добавляют 160 мг ППИК, смесь инкубируют при рН 5,7 в течение 1624 ч при 25РС.

Выделение ППИК, связанного с КМдекстраном, аналогично примеру 1. Полученное водорастворимое соединение ППИК с КМ-декстраном содержит 5О% белка от сухого вёса препарата и сохраняет 60% ингибирующей активности по отношению к трипсину..

Пример 3. 2ОО мг КМ-декстрана (ст.з. 0,6; средний М, 6 1О) )раотворяют в 1О мл раствора 0,1 М NaC8 и добавляют 100 мг 1-втил-3(3 -диэтиламинопропил)карбодиимида, рН реакцио ной смеси поддержттают 7,6 в течение ЗО мин. Затем к реакционной смеси добавляют 20 мг ППИК, смесь инкубируют рН 5,7 в течение 16-24 ч Выделение ППИК, связанного с Р М-декстраном, аналогично примеру 1. Получеии ное водорастворимое соединение ППИК с КМ-декстраном содержит 20% белка от сухого веса препарата и сохраняет 10О% ингибируюшей активности по отношению к трипсину.

Пример 4. Испытание антикининогеназной активности полученного соединения. Высокая биологическая активность и пролонгированность действия ППИК, связанного с КМ-декстраном, подтверждена данными о выживаемости и средней продолжительности жизни собак при экспериментальной форме острого панкреатита.

Острый панкреатит воспроизводился введением в главный панкреатический проток инкубационной смеси желчи с трипсином. Через 3 ч: в вену задней конечности вводят предлагаемое вещество. В эксперименте выделенй две контрольные группы животных: первую составили 11 собак, у которых лечение не проводилось; вторую 11 собак, у которых острый панкреатит Протекал на фоне применения поливалентно5го т1гибитора китгаогеназ в виде (ственного препарата - гордокса. oeoiso лекар-Результаты эксперимента лредставпены ь таблице.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет получить препарат поливале.нт кого панкреатическогх) ингибитора кинвногеназ, обладающий пролонгированным действием по сравнению с известным.

Формула изобретения

Способ получения поливалентного панкреатического ингибитора, обладающего антикининогеназным действием, включаю-. щий выделение ингибитора из органиа «а крупного рогатого скота, отличаю1-2

О

11

щий с я тем, что, с целью получения целевого продукта, обладающего длитепь ной антикининогеназной активностью, 1 « 8 вес.ч. поливалентного панкреатического 11нгибитора дополнительно обрабатывают : раствором смеси карбоксиметшэдекстрана и 1-9Тил-3-{з-«иэтиламинопрошш)карбодиимида при ИХсоотнощении 2,5-10-:-510 при рН 4,7 - 7,6 и 20-25С.

25

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

{. R.,We)e Е- KaE i1crein in itibors. Handbook of txpeHfuevitae Pjia r acoEog v. Ber-ewJQTO (прототип).