ШТАММ ГРИБА ASPERGILLUS SPECIES, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ОЧИСТКИ ВОДЫ ОТ ПЛАВАЮЩЕЙ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ Российский патент 1996 года по МПК C12N1/14 C02F3/34 C12R1/66 C12N1/14 

Изобретение относится к микробиологии и касается получения штамма-микромицета, пригодного для очистки поверхности воды от плавающей нефти и нефтепродуктов.

Для очистки водоемов и морских акваторий от плавающих нефтепродуктов используется два подхода. Традиционно применяют препараты сорбентов различного происхождения: пенополиуретан, перлит, вермикулит, угольная пыль, резиновая крошка, древесные опилки, пемза, торфяной мох [1] Указанные сорбенты достаточно эффективны и поглощают 40 80 мг нефти на мг сухого веса сорбента.

Однако перечисленные материалы имеют следующие недостатки: они быстро оседают на дно, что затрудняет их применение, многие из них по токсичности для экосистем превышает токсичность самого нефтяного поллютанта. С другой стороны для очистки от нефтезагрязнений часто используют биологические препараты.

Известны штаммы микромицетов-биодеструкторов нефти Streptomyces alboasialis"C", Aspergillus amstelodami, способные разрушать нефть и нефтепродукты в сточных водах с эффективностью до 50 [2 и 3]
Однако эти штаммы работают в узком диапазоне температур (25 30^oC) и применяются только для очистки сточных вод.

Широко применяется штамм Pseudomonas putida [4] обладающий высокими характеристиками по биодеградации нефти и нефтепродуктов.

Однако недостатком этого штамма является то, что он растет и утилизирует нефть лишь при сравнительно высокой температуре (28 42^oC). На 30-е сутки Preudomonas Putida утилизирует 65 74 нефти.

Целью изобретения является получение штамма-микромицета, обладающего способностью очищать пресную и морскую воду от поверхности загрязнения нефтью и нефтепродуктами в широком диапазоне температур в относительно короткие сроки.

Предлагаемый штамм Aspergillus sp.H1 выделен из образца сырой нефти Западно-Сибирского месторождения. Штамм депонирован Центральной коллекцией микроорганизмов Государственного концерна "Биопрепарат".

Предлагаемый штамм Aspergillus sp. H1 не токсичен, способен к самовоспроизводству, развивается из посевного материала на минеральной среде, используя в качестве источников углерода углеводороды нефти и нефтепродукты, долго держится на поверхности воды, образует прочную и легко удаляемую пленку. Культура микромицета удачно сочетает в себе свойства биодеструктора и биосорбента нефти и нефтепродуктов, что дает высокий суммарный эффект при очистке воды от нефтезагрязнений (до 99).

Полученный штамм характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки
На агаре Чапека-Докса с сахарозой через 48 ч обнаруживает умеренный рост. Образуются мелкие до 1 2 мм в диаметре колонки темно-зеленого цвета с развитым субстратным и скудным воздушным мицелием белого цвета. При старении воздушный мицелий окрашивается в болотный цвет.

На морковном агаре через 48 ч развиваются крупные, выпуклые с приподнятым центром колонии до 6 8 мм в диаметре. Колонии имеют развитой воздушный мицелий светло-болотного цвета, обрамлены белым окатом. Реверзум желто-коричневого цвета. Мицелий сегментирован, с включениями. Конидиальная головка имеет булавовидную форму, стеригмы двухярусные, конидии шаровидные с мелкими шипами. На мясопептонном бульоне растет, образуя непрочную пленку и пристеночное кольцо.

Физиолого-биохимические признаки
Штамм Aspergillus spH1 потребляет глюкозу, галактозу, не сбраживает лактозу, рамнозу, арабинозу и сахарозу. Отсутствие ферментов для утилизации сахарозы объясняет весьма умеренный рост на среде Чапека-Докса, содержащей в своем составе этот углевод. Развивается в мясопептонном бульоне, содержащем 2,5 и 6,5 NaCl. Обладает слабой протеолитической активностью, разжижает желатину.

Синтезирует амилазу и гидролизует крахмал. Обладает каталазной активностью. Усваивает углеводород нефти и нефтепродуктов. В жидкой минеральной среде развивается в виде прочной пленки, располагающейся на границе раздела водной и нефтяной фаз.

Условия хранения: в стерильной почве под вазелиновым маслом при 4^oC.

Штамм гриба Aspergillus sp. H1 способен расти на водных минеральных средах, содержащий в качестве источника углерода нефть, мазут, дизельное топливо. Усваивая углеводородный субстрат, микромицет формирует массивный мицелий, располагающийся на границе раздела двух фаз: нефть-вода, в виде прочной пленки.

В процессе роста микромицета нефть или нефтепродукты, изначально располагающиеся на поверхности воды, претерпевают следующие изменения: легкие фракции испаряются, часть углеводородов подвергается биодеградации, усваивается микромицетом и идет на построение мицелия. Оставшийся субстрат впитывается мицелием, сорбируется в его полостях и прочно удерживается в этом биологическом сорбенте. Грибная пленка, пропитанная нефтью или нефтепродуктами, и представляющая собой биосорбент, механическим путем удаляется с поверхности воды, оставляя практически свободную от нефти жидкость.

Многократные опыты, проведены в лаборатории с данным микромицетом, выявили следующие закономерности. В диапазоне температур от 10 до 37^oC на поверхности пресной и морской воды, загрязненной нефтяным пятном (пленка толщиной 0,5 6,0 мм), при уровне загрязнения 1 5 из спор в течение 7 - 14 сут развивается грибная пленка, сорбирующая нефть. С помощью весового метода химической экстракции хлороформом было выявлено, что в процессе роста микромицета утилизируется до 15-20% испаряется и теряется при манипуляциях до 20-30% сорбируется до 86% углеводородного субстрата от исходного уровня загрязнения.

В итоге загрязнение поверхности воды нефтью и нефтепродуктами ликвидируется на 80 99
Испытание проводили при 10 и 25^oC в водопроводной и морской воде, содержащей в качестве минеральной добавки двузамещенный фосфат аммоний в концентрации 0,35 г/л.

П р и м е р 1. Штамм Aspergillus sp. H1 выращивали в 100 мл колбах, содержащих 25 мл стерильной среды. На поверхности жидкости наслаивали пленку нефтепродуктов, толщиной 0,5 мм, что составляло около 1 по весу. Нефть, мазут, дизельное топливо предварительно стерилизовали. Затем среду инфицировали спорами микромицета из расчета 10⁷ спор/мл. В качестве контроля использовали неинфицированные колбы. Опыт проводили при температуре 25^oC и 10^oC в стационарных условиях.

По окончании опыта методом экстракции нефти хлороформом с последующим взвешиванием сухого остатка оценивали количественный вклад в очистку процесса биосорбции, биодеструкции, естественных потерь. Определяли коэффициент биосорбции, т. е. количество (мг) сорбированного субстрата на единицу веса (мг) сухого веса микромицета. Результаты опытов по очистке поверхности воды от нефтезагрязнений представлены в таблице.

Наблюдая за динамиков роста микромицета, мы убедились, что уже на 7 сут при 25^oC на границе раздела нефть-пресная вода развивалась грибная пленка, способная сорбировать до 57,1 плавающей нефти. При этом эффективность очистки составляла 74,2 С увеличением срока наблюдений до 14 дн масса биосорбента нарастала, пленка становилась прочнее, а доля биодеградации и эффективность очистки возрастали на 10,9 и 8,9 соответственно. Дальнейшее увеличение срока экспозиции до 21 дн практически не приводило к увеличению эффективности очистки. Коэффициент биосорбции в течение срока наблюдений варьировал незначительно в пределах 8,2^oC11,8.

Таким образом, при 25^oC в пресной воде нефтяное пятно толщиной 0,5 мм подвергается эффективной очистки (до 80%) микромицетом Aspergillum sp. H1 в течение 7 14 сут. С понижением температуры до 10^oC процесс развития микромицета удлиняется, а эффективность очистки незначительно (до 76,9%) снижалась.

Штамм Aspergillus sp. H1 снимает загрязнения нефтью морской воды как при 25^oC так и при 10^oC с эффективностью 78,4 и 57,4 соответственно.

Кроме нефтяных пятен предлагаемый штамм с высокой эффективностью (до 97) очищает загрязнения пресной воды мазутом и дизельным топливом. Следует отметить, что при относительно высоком уровне загрязнения мазутом (1,8) биосорбент поглощал 44,0 мг субстрата в расчете на 1 мг сухого веса, что значительно превышало коэффициент биосорбции при очистке воды от пятен дизельного топлива и нефти.

П р и м е р 2. Штамм Aspergillus sp. H1 выращивали в условиях, имитирующих нефтяной разлив. Опыт проводили в двух модификациях. В первом случае в эксикатор заливали 0,75 л на поверхность нефтяное пятно размером 153 см²x1,0мм. В другом случае эксикатор заполняли тремя литрами пресной воды и наносили нефтяное пятно размером 490см²x3,0 мм. Среду инфицировали спорами из расчета 10⁷ спор/см². Инкубацию проводили при 25^oC. Формирование прочной грибной пленки заканчивалось уже к исходу двух недель. Однако мы продолжали эксперимент до 45 дней и убедились, что биосорбент, напитанный нефтью, держится в течение этого срока на поверхности воды. По окончании эксперимента пленку биосорбента механически удаляли с поверхности воды и с помощью метода экстракции хлороформом определяли эффективность очистки нефтяного загрязнения. Результаты эксперимента представлены в таблице. Эффективность очистки была превосходной и составила в первом эксикаторе 89,9 а во втором 99,6 Коэффициент биосорбции составлял 21,8 и 18,2 соответственно.

Сравнение предлагаемого штамма микромицета с известными бактериальными препаратами (например с препаратом "Путидойл") затруднено в силу того, что в основе механизма очистки водных поверхностей от нефтезагрязнений из грибного и бактериального препаратов лежат разные принципы. Бактериальный препарат производит очистку от нефтезагрязнения только за счет биохимического окисления нефтяного субстрата, т.е. в процессе биодеградации. Действие микромицета основано на двух взаимосвязанных процессах, а именно на процессе биодеградации нефти, и сопряженным с ним формированием тела гриба, и на процессе биосорбции практически всей оставшейся неокисленной нефти. Если сравнить бактериальный и грибной штаммы по уровню биодеградации, то первый превосходит второй (на 30 - 40). Однако если сравнивать препарат по окончательному результату, т. е. по эффективности очистки поверхности воды от нефтезагрязнения, то грибной штамм более эффективен и дает превосходные (до 99 очистки) результаты.

Биосорбент на основе штамма микромицета Aspergillus sp. H1 способен эффективно утилизировать и собирать плавающую нефть, мазут и дизельное топливо с водных поверхностей. Предлагаемый биосорбент удачно сочетает в себе свойства, присущие микромицетам-биодеструкторам [1 и 2] и химическим нефтесорбентам [3] Результат сочетанного действия проявляется в исключительно высокой (до 99) эффективности очистки водных поверхностей от нефтезагрязнений, что превышает эффективность действия указанных микромицетов-биодеструкторов на 40 50 Проводя сравнение по показателю коэффициента сорбции, следует отметить, что предлагаемый биосорбент не уступает химическим аналогам. Сравнение с известными препаратами бактерий-биодеструкторов нефти на основе штамма Pseudomonas putida 36/4 и штамма Micrococeus sp. IM [4] выявляет более высокую результативность (на 20 больше) предлагаемого биосорбента.

Предлагаемый штамм перспективен для получения на его основе биосорбента, пригодного для очистки плавающей нефти и нефтепродуктов в отстойниках, очистных сооружениях и при разливах нефти на поверхности пресных и морских водоемов.

Использование: относится к микробиологии и может быть использовано для охраны окружающей среды. Сущность изобретения: для очистки воды от плавающей нефти и нефтепродуктов предлагается новый штамм гриба Aspergillus sp. H1, задепонированный в ЦКМ Государственного концерна "Биопрепарат". 1 табл.

Штамм гриба Aspergillus species ЦКМ F_σ-525"Б"2 (Государственный концерн "Биопрепарат"), используемый для очистки воды от плавающей нефти и нефтепродуктов.