ПЛОТНАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ Российский патент 1999 года по МПК C12Q1/02 

Изобретение относится к микробиологии и касается питательных сред для возбудителя сибирской язвы.

Известна яично-желточная питательная среда для дифференциации B. anthracis от близкородственных сапрофитов /1, 3/. Недостатками среды являются непостоянство проявления признака лецитиназообразования как у сибиреязвенных штаммов, так и у близкородственных бацилл, а также невозможность проведения дифференциации капсулообразующих и бескапсульных штаммов B. anthracis. Среда не позволяет одновременно проводить выделение возбудителя сибирской язвы и дифференциацию его от близкородственных сапрофитов, так как высев на яично-желточный агар является одним из этапов идентификации B. anthracis /6/.

Известна среда с кровяным агаром, используемая для дифференциации возбудителя сибирской язвы от споровых сапрофитов /3, 5/. Эта среда имеет те же недостатки, что и яично-желточная /4, 8/.

Наиболее близкой к изобретению является плотная питательная среда, содержащая питательную основу, pH-индикатор - фенолфталеинфосфат натрия, агар. Среда позволяет дифференцировать B. anthracis от близкородственных сапрофитов по признаку фосфатазообразования. Недостатки среды заключаются в следующем;
1) Нестабильности синтеза на ней щелочной фосфатазы;
2) невозможности проведения дифференциации между капсулообразующими и бескапсульными штаммами;
3) среда не позволяет одновременно проводить выделение и окончательную дифференциацию B. anthracis от споровых сапрофитов /2, 7/.

Следовательно, в настоящее время вопрос о создании дифференциальной среды для диагностики B. anthracis остается актуальным.

Цель изобретения - повышение дифференцирующих свойств среды.

Поставленная цель достигается тем, что плотная питательная среда для выявления возбудителя сибирской язвы, содержащая питательную основу, pH-индикатор, агар и воду дополнительно содержит D-сорбит, а в качестве pH-индикатора - бромтимоловый синий, при следующем соотношении компонентов (мас. %):
Питательная основа - 1,5 - 2
D-сорбит - 1 - 2
Бромтимоловый синий - 0,025 - 0,003
Агар-агар - 1,5 - 2
Вода - остальное
В качестве питательной основы может быть использовано питательное сырье, на котором бактерии B. anthracis дают рост и размножение, например гидролизат кильки, дрожжевой экстракт, ферментативный гидролизат мяса или рыбы и др.

Только при вышеперечисленных концентрациях компонентов питательной среды достигается поставленная цель. Бромтимоловый синий в концентрациях 0,001% и 0,005% не позволяет достичь поставленной цели, так как в первом случае слабо окрашивает колонии бактерий, во втором - оказывает ингибирующее действие, проявляющееся в уменьшении размеров колоний, а также в снижении биологической концентрации (БК) на 30 - 50% по сравнению с контрольной средой (контрольная среда - агар Хоттингера).

Среда ингибирующими свойствами не обладает: БК на контрольной среде = 100%, на среде с D-сорбитом = 95 ± 5%.

Пример 1. Плотную питательную среду готовят следующим образом:
Для приготовления питательной среды отдельно готовят следующие компоненты:
1. 20%-ный раствор D-сорбита. Для этого 20 г D-сорбита растворяют в 80 мл дистиллированной воды. Стерилизуют, нагревая до кипения.

2. 1,6%-ный спиртовый раствор бромтимолового синего. Для этого 1,6 г pH-индикатора растворяют в 100 мл 96^o этилового спирта.

3) в дистиллированную воду добавляют агар-агар и гидролизат кильки до рабочей концентрации 1,5% (каждого из компонентов), нагревают до 50 - 60^oC для растворения гидролизата кильки.

Устанавливают pH 7,3 - 7,4. Стерилизуют в автоклаве при 112^oC в течение 15 - 20 минут.

После охлаждения агаризованной питательной основы до 45^o - 50^oC в нее добавляют стерильной 20%-ный раствор D-сорбита и 1,6%-ный спиртовый раствор бромтимолового синего до рабочей концентрации 1% и 0,025% соответственно. Значение pH среды после смешивания компонентов должно составлять 7,2 - 7,3. При этом среда имеет сине-зеленое окрашивание. Среду разливают в чашки Петри. Посев бактерий производят на застывшие агаровые поверхности.

Пример 2. Исходные растворы компонентов питательной среды готовят и стерилизуют, как в примере N 1, используя 2% дрожжевой экстракт, агаризуя среду до рабочей концентрации, равной 2%.

Смешивание стерильных компонентов среды проводят, как в примере N 1, доводя концентрации D-сорбита до бромтимолового синего в среде до 2% и 0,003% соответственно. Среду сине-зеленого цвета разливают в чашки Петри, посев бактерий производят на застывшие агаровые поверхности.

Пример 3. Использование среды для выявления B. anthracis и одновременной его дифференциации от близкородственных сапрофитов, а также дифференциации капсулообразующих и бескапсульных штаммов возбудителя сибирской язвы.

Посевной материал вирулентного штамма 836 (капсулообразующий), авирулентного штамма СТИ-1 (бескапсульный), а также близкородственных сапрофитов B. cereus шт. 1408, B. thuringiensis шт. 1415 наносят на чашки с плотной средой с D-сорбитом, растирая шпателем до получения единичных колоний, используя при этом не менее пяти чашек. В качестве контрольных сред используют агар Хоттингера и среду с фенолфталеинфосфатом натрия (прототип). На каждую из вышеперечисленных сред высевают как монокультуры исследуемых штаммов бактерий, так и их смеси.

Получение посевного материала. В качестве посевного материала могут быть использованы как вегетативные, так и споровые клетки бактерий, выращенные на скошенном в пробирке агаре при температуре 36 ± 1^oC. Смыв микроорганизмов с поверхности агара проводят стерильным физиологическим раствором. Полученные суспензии бактерий используют для высева на чашки. Инкубирование посевов проводят при температуре 36 ± 1^oC в течение 2 - 3 часов. Результаты высева представлены в таблице.

Из таблицы следует, что при выращивании штаммов 836, СТИ-1, B. cereus 1408, B. thuringiensis 1415 на агар Хоттингера отличить колонии друг от друга не представляется возможным. При посеве этих же штаммов на среду с фенолфталеинфосфатом натрия (прототип) является возможность дифференциации сибиреязвенных штаммов (836 и СТИ-1) от близкородственных сапрофитов - шт. 1415 B. thuringiensis и шт. 1408 B. cereus по цвету образуемых ими колоний. Однако дифференцировать штамм 836 от шт. СТИ-1 невозможно, т.к. они имеют одинаковое окрашивание колоний, которые не отличаются по морфологии. Кроме того, шт. N 5 "Тула" (вирулентный) на данной среде дал слабо-розовое окрашивание, что не характерно для сибиреязвенных штаммов.

Выращивание вышеперечисленных штаммов на среде D-сорбитом позволяет провести дифференциацию колоний штаммов вирулентных (шт. 836) и авирулентных (СТИ-1) как друг от друга, так и от близкородственных сапрофитов (шт. B. cereus 1408, шт. B. thuringiensis 1415), как по цвету, так и по морфологии колоний. Сибиреязвенные вирулентные и авирулентные штаммы (шт. 836, шт. СТИ-1), утилизируя D-сорбит, закисляют среду, в результате чего рH-индикатор приобретает желто-зеленое или зеленое окрашивание. Штамма близкородственных сапрофитов (шт. B. cereus 1408, B. thuringiensis 1415) защелачивают среду с D-сорбитом, pH- индикатор окрашивается в сине-зеленый цвет.

На средах, представленных в табл., апробированы 29 штаммов бактерий. Из них 7 штаммов сибиреязвенных вирулентных, 9 штаммов авирулентных и вакцинных и 13 штаммов близкородственных споровых сапрофитов (B. cereus, B. thuringiensis, B. mesentericus, B. subtilis). Все исследованные штаммы на среде с D-сорбитом окрашивались в характерный для данного вида цвет (сибиреязвенные вирулентные - в желто-зеленый; сибиреязвенные авирулентные - в зеленый; штаммы B. cereus, B. thuringiensis, B. mesentericus, B. subtilis - в сине-зеленый) и приобретали типичную для него морфологию.

Предлагаемая плотная питательная среда с D-сорбитом для выявления возбудителя сибирской язвы характеризуется перед ранее известными средами следующими преимуществами:
- позволяет стабильно и эффективно проводить одновременно выделение и дифференциацию B. anthracis;
- среда может быть использована для диагностики возбудителя сибирской язвы;
- время выделения и дифференциации возбудителя сибирской язвы сокращается с 3 суток до 28 - 36 часов;
- среда позволяет проводить не только межвидовую дифференциацию бактерий (вид anthracis от видов cereus, thuringiensis, mesentericus, subtilis), но и внутривидовую - вирулентных и авирулентных сибиреязвенных штаммов по цвету и по морфологии их колоний;
- на среде возможно определение диссоциации в культуре сибиреязвенных штаммов. Например, культура II вакцины Ценковского (штамм 71/12) образует колонии двух типов, характерные по цвету и по морфологии как для вирулентных, так и для авирулентных бацилл B. anthracis;
- использование среды с D-сорбитом предполагает удешевление процедуры выделения и дифференциации B. anthracis, так как в этом случае исчезнет необходимость использования целого ряда методов - проба со специфическим сибиреязвенным бактериофагом, определение гемолитической, лецитиназной, фосфатазной активностей.

Вышеперечисленные преимущества плотной питательной среды с D-сорбитом позволяют использовать ее для выделения возбудителя сибирской язвы и одновременной дифференциации его от близкородственных споровых бацилл, а также дает возможность проведения внутривидовой дифференциации (между вирулентными капсулообразующими и авирулентными бескапсульными штаммами B. anthracis).

Источники информации
1. Груз Е.В. Диагностическая ценность некоторых морфологических, культуральных и биохимических признаков палочки антракса. - В кн.: "Антракс, Кишинев" Карта Молдавеняскэ,1964, с. 124 - 138.

2. Еременко Е. И. , Буравцева Н.П., Бобрышев В.И. и др. Использование дифференциального теста на щелочную фосфатазу в селективных средах для сибиреязвенного микроба. - В сб.: Современные аспекты профилактики зоонозных инфекций. Иркутск, 1984, ч. 3, с. 11 - 13.

3. Инструкция и методические указания по лабораторной, клинической диагностике, профилактике и лечению сибирской язвы у людей. М., 1980, 63 с.

4. Мелихов А. Д. Об использовании кровяного агара при дифференциации сибиреязвенной палочки и некоторых почвенных аэробных бацилл. -Труды МВА . - М., 1957, т. 19, в 2 ч, ч.1, с. 86 - 88.

5. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. Под ред. М.О.Биргера. - М.: Медицина, 1973, с.80.

6. Шляхов Э. Н., Груз, Присакарь В.И. Сибирская язва (очерки эпидемиологии, лабораторной диагностики и профилактики). - Кишинев: Штиинца, 1975, 162 с.

7. Dobozy A., Hammer H. Some properties of alkaline phosphatase in Bacillus species. - Acta microbiol, Acad Sci hung, 1969, 16, p. 181 - 187.

8. Scidel Y., Strassinon K. Inzbacteriologischen und serologischen diagnose des Milzbrandes. - Arch. exp. Vet. Med., 1956, Bd10, N3, s. 325 - 327.

Среда предназначена для выделения и дифференциации возбудителя сибирской язвы от близкородственных споровых сапрофитов. В состав среды входит питательная основа, pH-индикатор, агар-агар, D-сорбит и дистиллированная вода. В качестве pH-индикатора используют бромтимоловый синий. Среда позволяет не только выделить возбудителя сибирской язвы, но и дифференцировать вирулентные капсулообразующие и авирулентные бескапсульные штаммы. 1 табл.

Плотная питательная среда для выявления возбудителя сибирской язвы, содержащая питательную основу, pH-индикатор, агар и воду, отличающаяся тем, что, с целью повышения дифференцирующих свойств среды, дополнительно содержит D-сорбит, а в качестве pH-индикатора - бромтимоловый синий, при следующих соотношениях компонентов, мас.%:
Питательная основа - 1,5 - 2
D-Сорбит - 1 - 2
Бромтимоловый синий - 0,015 - 0,003
Агар-агар - 1,5 - 2
Вода - Остальноеt