ШТАММ БАКТЕРИЙ AUREOBACTERIUM SAPERDAE - ДЕСТРУКТОР ФЕНОЛА Российский патент 2003 года по МПК C12N1/20 C02F3/34 B09C1/10 C12N1/20 C12R1/01 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к средствам борьбы с загрязнением окружающей среды. В экологическом отношении промышленные аварийные ситуации, связанные с разливом токсичных химических жидкостей и нефтепродуктов наиболее опасны, так как сопровождаются неконтролируемым распространением вредных веществ в трех средах: почве, поверхностных и грунтовых водах, атмосферном воздухе. Процесс самоочищения в естественных условиях очень длителен, что связано с бедностью микрофлоры, окисляющей токсичные вещества, дефицитом биогенных веществ (азота, фосфора), низкой температурой и резким колебанием рН очищаемой среды.

Целью изобретения является получение нового активного штамма-деструктора токсичного вещества фенола. Из литературных источников, патентов известно, что при биологической очистке токсикантов, относящихся к различным по структуре соединениям необходимы микроорганизмы-деструкторы с широким спектром субстратной специфичности.

Многие исследователи в нашей стране и за рубежом ведут интенсивные работы по селекции микроорганизмов, которые окисляют токсичные соединения. Например, Рустемов С.А., Головлева Л.А. с соавторами предложили штамм бактерий Pseudomonas aeruginosa, разлагающий α-метилстирол и толуол (см. авторское свидетельство SU 1375647, кл. С 12 N 1/20. БИ 7, 1988) и штамм бактерий Methylobacterium species, разлагающий метанол и/или формальдегид (см. авторское свидетельство SU 1017730, кл. С 12 N 1/20, 1982).

Наиболее близким по техническому решению к изобретению является штамм Pseudomonas cepacia ВДК ВКПМ-7559-деструктор фенола и формальдегида (см. авторское свидетельство RU 2144079, кл. С 12 N 1/20, С 02 F 3/34. БИ 1, 2000). Известный штамм способен деградировать смесь фенола и формальдегида с исходной концентрацией 400 и 500 мг/л соответственно в присутствии биогенной добавки глицерина и фосфорной кислоты. Недостатком известного штамма Pseudomonas cepacia ВДК ВКПМ-7559 является деградация невысокой концентрации смеси фенола и формальдегида, то есть менее одного грамма на литр и отсутствие результатов испытаний Pseudomonas cepacia ВДК ВКПМ-7559 на пилотной установке по очистке промышленных и бытовых стоков, содержащих фенол и формальдегид, где концентрация поступающих стоков с токсикантами варьирует, что не позволяет рассчитать нагрузку на очистные сооружения по токсикантам, а использование второго источника углерода - глицерина до 0,2% в конечной концентрации удорожает процесс очистки.

Целью изобретения является получение нового штамма, способного окислять фенол в более высоких концентрациях: от 1,5 до 2,0 г/л, что выше прототипа в два раза и при более низкой температуре (15-20)^oC, а также отсутствие второго источника углерода - глицерина - в качестве биогенной добавки.

Селекционированный штамм Aureobacterium saperdae 6-204 выделен из накопительной культуры образца почв Чувашии, где в 1996 году произошло крушение грузового поезда с фенолом. Данный грунт характеризуется содержанием фенола от 0,14 г/кг до 1,754 г/кг.

Характеристика штамма Aureobacterium saperdae 6-204.

Среда для хранения: МПА (мясопептонный агар).

Культурально-морфологические признаки: на мясопептонном агаре образуются желтые мелкие блестящие каплевидные цельные колонии, край гладкий, структура колонии однородная, диаметр молодой колонии 2-2,5 мм, старой 3-3,5 мм. Пигмент не диффундирует в среду. Бактерии грамположительные, неспорообразующие, некислотоустойчивые, палочки 1,05•2,5-1,0•3,0 мкм. Одиночные, некоторые в парах, V-образной конфигурации или палисадные в виде параллельно лежащих палочек, встречаются кокковидные клетки 0,7•0,7-1,05•1,05 мкм. В старых культурах палочки обычно короткие, мицелий не образуют. Клетки слабо подвижные.

Физиолого-биохимические признаки: аэробы, метаболизм дыхательного типа с образованием небольшого количества кислоты, но не газа из глюкозы, сахарозы, мальтозы, маннозы. Бактерии каталазоположительные, желатину не разжижают, молоко не свертывают и не пептонизируют. Нитраты не восстанавливают. На ломтике картофеля обильный рост с бежево-желтым пигментом. В МПБ слизистая пленка, умеренная муть, осадок скудный. Хорошо растет в диапазоне рН среды 6,8-7,4, при температуре 15-20^oС, индол и сероводород не образует. Штамм не патогенен и нетоксичен.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Периодическое культивирование проведено в качалочных колбах на минеральной среде 10 следующего состава, г/л: (NH₄)₂SO₄ 3; КН₂РO₄ 6,5; MgSO₄ 0,7, микроэлементы: FeSO₄, ZnSO₄, MnSO₄ - пo 12,5 мг/л; CuSO₄ 3 мг/л и 0,05% дрожжевого автолизата, рН среды 6,8-7,2, температура 15-20^oС. В качестве единственного источника углерода использовали фенол в концентрации 1,8-2,0 г/л. Выращивание длилось в течение 7 суток на круговой качалке с 180 об/мин, ватные пробки качалочных колб были прикрыты двойной полиэтиленовой пленкой, чтобы не улетучивался фенол. В результате ферментации получили содержание остаточного фенола 30-50 мг/л, то есть процент утилизации составил более 90%.

Пример 2. Проведена и испытана иммобилизация на торфе фенолокисляющей культуры Aureobacterium saperdae 6-204. Для этого штамм бактерий выращивался на минеральной среде, описанной в Примере 1, и переносился на торф путем полива из лейки, подсушивался при комнатной температуре и использовался в батарее биофильтров. Торф является наиболее технологичным в данном случае материалом, поскольку в дальнейшем может быть использован в качестве структуратора грунта.

Таким образом, предлагаемый штамм бактерий Aureobacterium saperdae 6-204 обеспечивает более высокую утилизацию фенола (в 2 раза по сравнению с известным штаммом Pseudomonas cepacia) в лабораторных и камеральных условиях при более низкой температуре 15-20^oС, что позволяет его использовать при очистке загрязненных фенолом почв, а также поверхностных и грунтовых вод. Штамм иммобилизован на торфе и используется в батарее из пяти биофильтров, в каждом из которых происходит десятикратное снижение концентрации фенола. Штамм устойчив в длительном непрерывном процессе, не нуждается в дополнительных факторах роста и обеспечивает высокую эффективность очистки от фенола.

Пример 3. На пилотной установке проверена комплексная технология очистки почв, поверхностных и грунтовых вод, включающая следующие стадии:
- извлечение загрязнений из грунта путем промывки водой;
- двухстадийная биологическая очистка промывной воды путем осаждения фенола железохелатным комплексом и последующей биодеградацией остаточного фенола из воды иммобилизованным на торфе селекционированным штаммом Aureobacterium saperdae 6-204.

Биокаталитическая деградация фенола из водных растворов проводилась методом коагуляции железохелатным комплексом - продуктом метаболизма бактерий Tiobacillus ferrooxidans. В качестве реагента (коагулянта) использовалась культуральная жидкость бактерий, выращенных на минеральной среде при рН среды 2,0-3,0 и температуре 28-30^oС в аэробных условиях. Железохелатный комплекс использовался в качестве коагулянта при осаждении различных поверхностно-активных веществ и в качестве активного окислителя сульфидов и фенолов. На второй стадии окисление фенолов проводилось новым бактериальным штаммом Aureobacterium saperdae 6-204, выделенным из образцов почв, пропитанных разлитым фенолом на месте аварии. Штамм развивался при температуре 15-20^oС в диапазоне рН среды 6,8-7,4. Собрана лабораторная установка непрерывного действия для осуществления процесса биодеградации фенолов из водных растворов, представляющая собой батарею из пяти биофильтров, в каждом из которых происходило десятикратное снижение концентрации фенола до 1-2 мг/л.

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к средствам борьбы с загрязнением окружающей среды фенолом. Новый штамм Aureobacterium saperdae 6-204 устойчив в длительном непрерывном процессе биокаталитической деградации фенола, может быть иммобилизирован на торфе и использоваться в батарее из 5 биофильтров, в каждом из которых происходит десятикратное снижение концентрации фенола. Техническим результатом изобретения является получение штамма Aureobacterium saperdae, способного окислять фенол в высоких концентрациях (1,5-2,0 г/л) при более низкой температуре (15-20^oС).

Штамм бактерий Aureobacterium saperdae 6-204 - деструктор фенола.