СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ СПАЕЧНОЙ БОЛЕЗНИ БРЮШИНЫ У ДЕТЕЙ Российский патент 1998 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, а именно к детской хирургии и клинической иммунологии, и может быть использовано для диагностики спаечной болезни брюшины у детей, оперированных по поводу острого аппендицита. Клинически уже давно доказана большая частота спаечной болезни после апендэктомии. (Симонян К. С. Спаечная болезнь. - М., Медицина, 1966; Г.А. Баиров, 1983), что обосновывает актуальность изобретения. Известно, что мононуклеарные фагоциты могут принимать активное участие в механизмах регуляции формирования соединительной ткани, в частности в механизмах регуляции синтеза и деградации коллагеновых структур (Stricklin G.P., Welgus H.G., 1983; Roberts A. et aj., 1986). Известно, что L-гидроксипролин является одним из конечных продуктов распада коллагена (Lehninger A. L., 1972). Нами была высказана гипотеза о том, что свободный L-гилроксипролин может выступать в роли одного из регуляторов функциональной активности мононуклеарных фагоцитов по типу обратной связи. Можно было ожидать, что в присутствии повышенных концентраций свободного L-гидроксипролина способность моноцитов больных спаечной болезнью брюшины к распластыванию на субстрате может отличаться от таковой в норме.

Задача изобретения - определение индекса активации распластывания моноцитов в присутствии различных концентраций L-гидроксипролина для повышения точности диагностики спаечной болезни брюшины у детей после операции по поводу деструктивного аппендицита.

Цель изобретения - повышение точности диагностики спаечной болезни брюшины у детей после операции по поводу деструктивного аппендицита.

Способ состоит в определении индекса активации распластывания моноцитов в присутствии различных концентраций L-гидроксипролина, содержащегося в инкубационной среде (ИАРМ) и осуществляется следующим образом. Из венозной крови выделяют мононуклеарные клетки методом разделения в градиенте плотности (при использовании разделяющей смеси, включающей фиколл и верографин, с плотностью d = 1,078), проводят постановку реакции распластывания моноцитов на покровном стекле в лунках из "Parafilm" (Sigma, USA) с диаметром 4,5 мм. В 4 лунки вносят микропипеткой по 0,02 мл клеточной суспензии, содержащей 4•10⁶ мононуклеарных клеток (в среде для культивирования RPMI), клетки инкубируют во влажной атмосфере, содержащей 5% CO₂ при 37^oC в течение 40 мин для прикрепления моноцитов к стеклу. Затем стекла с клетками споласкивают в среде RPMI для удаления лимфоцитов и проводят постановку реакции распластывания моноцитов в среде, содержащей 10, 15, 30 и 60 мкг/мл L-гидроксипролина в разных лунках, инкубируют стекла во влажной атмосфере, содержащей 5% CO₂ при 37^oC. Через 30 мин после начала культивирования клеток с L-гидроксипролином стекла споласкивают в свежей порции среды RPMI и при использовании фазово-контрастного микроскопа подсчитывают количество (%) распластанных моноцитов во всех лунках. Находят индекс активации распластывания моноцитов в присутствии повышенных концентраций L-гидроксипролина (ИАРМ) в среде для культивирования по формуле: ИАРМ = a + b + c/k, где a - процент распластанных моноцитов в среде, содержащей 15 мкг/мл гидроксипролина, b - процент распластанных моноцитов в среде, содержащей 30 мкг/мл гидроксипролина, c - процент распластанных моноцитов в среде, содержащей 60 мкг/мл гидроксипролина, k - процент распластанных моноцитов в среде, содержащей 10 мкг/мл гидроксипролина (исходное содержание гидроксипролина в среде RPMI, входящего в состав этой среды в качестве одного из ее компонентов).

Если ИАРМ находится в пределах 3,5 - 4,4, то это свидетельствует об отсутствии спаечного процесса. Если величина ИАРМ находится в пределах 4,4 - 5,0, то это свидетельствует о наличии спаечного процесса брюшины. Превышение ИАРМ более 5,0 позволяет диагностировать распространенный спаечный процесс.

Клинические данные.

Пример 1. Обследовано 3 группы детей в возрасте от 6 до 14 лет. I группа - 28 пациентов с диагнозом "спаечная болезнь брюшины", оперированные ранее по поводу острого флегмонозного аппендицита и местного гнойного перитонита. II группа - 34 ребенка того же возраста, обследование в течение 7 дн после операции, проведенной впервые по поводу острого флегмонозного аппендицита и местного гнойного перитонита. III группа - контрольная. 29 детей 6 - 14 лет, практически здоровых, направленных для плановой операции по поводу небольших неосложненных грыж и ограниченных доброкачественных опухолей (липомы, папилломы). Средние величины ИАРМ в I, II и III группах составили соответственно 5,05 + 0,37; 3,96 +0,18; и 2,97 + 0,06. Величина ИАРМ в группе I (спаечная болезнь) была достаточно выше этого показателя в II (p<0,001) и III группах (p<0,01). Наиболее распространенный спаечный процесс отмечен при показателе 5,0 и выше. Статистически достоверная разница в показателях ИАРМ между II и III группой (p<0,001) свидетельствовала о возможности развития спаечного процесса брюшины в ранние сроки после операции.

Экспериментальные данные.

Пример 2. У крыс линии Wistar 2-месячного возраста оценивали ИАМР через различные интервалы времени после создания биологической модели аппендикулярного перитонита. Крыс забивали через 3, 5 и 7 суток после операции. В эти сроки средние величины ИАРМ у крыс со спаечным процессом в брюшной полости соответственно составили 4,97; 4,42; 4,49. При отсутствии спаечного процесса величины ИАРМ равнялись в эти же сроки 3,28; 3,63 и 3,50. Оценку степени выраженности спаечного процесса в брюшной полости проводили визуально. При статистической обработке отмечена четкая корреляция между интенсивностью спаечного процесса и величиной ИАРМ (r = 0,79; p<0,01).

Использование: в медицине, а именно в детской хирургии и клинической иммунологии, и может применяться для диагностики спаечной болезни брюшины у детей, оперированных по поводу острого аппендицита. Сущность изобретения: адгезированные на стекле моноциты крови культивируют в четырех лунках в среде, содержащей 10, 15, 30 и 60 мкг/мл L-гидроксипролина в течение 30 мин во влажной атмосфере, содержащей 5% CO₂ при 37^oC, подсчитывают количество распластанных моноцитов во всех лунках, определяют по формуле индекс активации распластывания моноцитов и при значениях индекса активации распластывания моноцитов 4,4 - 5,0 диагностируют наличие спаечного процесса в брюшной полости, при значениях индекса, превышающего 5,0, диагностируют распространенный спаечный процесс, а при низких значениях индекса 3,5 - 4,4 диагностируют отсутствие спаечной болезни брюшины. Предлагаемый способ позволяет повысить точность диагностики спаечной болезни брюшины у детей после операции по поводу деструктивного аппендицита.

Способ диагностики спаечной болезни брюшины у детей, отличающийся тем, что адгезированные на стекле моноциты крови культивируют в 4 лунках в среде, содержащей 10, 15, 30 и 60 мкг/мл L-гидроксипролина в течение 30 мин во влажной атмосфере, содержащей 5% СО₂, при 37^oС, подсчитывают количество распластанных моноцитов во всех лунках, определяют по формуле индекс активации распластывания моноцитов и при значениях индекса активации распластывания моноцитов 4,4 5,0 диагностируют наличие спаечного процесса в брюшной полости, при значениях индекса, превышающих 5,0, диагностируют распространенный спаечный процесс, а при низких значениях индекса (3,5 4,4) диагностируют отсутствие спаечной болезни.