СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ КЛЕТОК-ПРЕДШЕСТВЕННИЦ ЭПИТЕЛИОИДНЫХ КЛЕТОК В МАЗКАХ КРОВИ Российский патент 1999 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, а именно к гематологии и клинической иммунологии, и может быть использовано для идентификации ранних коммитированных клеток-предшественниц эпителиоидных клеток (пре-ЭК) в мазках крови животных и человека в норме и патологии, в частности при патологических процессах, при которых в организме развиваются ЭК-гранулемы, главным образом, при различных гранулематозных болезнях. Необходимость данного изобретения продиктована потребностями медицины в разработке новых методов дифференциальной диагностики гранулематозных болезней, а также новых методов оценки эффективности их лечения.

Известно, что эпителиоидные клетки (ЭК) образуются в очагах гранулематозного воспаления при патологических процессах различной этиологии. Эпителиоидно-клеточные гранулемы или отдельные скопления ЭК (ЭК-кластеры) формируются при многих инфекционных заболеваниях, при некоторых ревматических и аутоиммунных заболеваниях, при лимфопролиферативных заболеваниях и гистиоцитозах, при развитии опухолей различного гистогенеза, при заболеваниях неизвестной или недостаточно изученной этиологии, при попадании в организм солей некоторых металлов, инородных тел, полимеров, аллергенов различного происхождения, а также при ряде патологических состояний организма.

В настоящее время считается общепризнанной следующая концепция происхождения и дифференцировки ЭК. Утверждается, что ЭК трансформируются из макрофагов (Мф), находящихся в очаге, где протекает патологический процесс (воспаление и т.п.), и при некоторых условиях - непосредственно из моноцитов (Мн) крови. В тех случаях, когда говорится о дифференцировке Мн в ЭК, предполагается, что Мн сохраняют практически равные потенции к дифференцировке в Мф и ЭК, но в силу какого-то особенного сочетания факторов, формирующих микроокружение в очаге воспаления или опухолевой ткани, включается определенная генетическая программа, и происходит детерминация Мн, направляющая дифференцировку Мн в ЭК.

Еще в относительно "старых" работах по гематологии указывалось на то, что определенная гетерогенность в популяции Мн может быть связана с их различным происхождением. Н.Д.Стражеско и Д.Н.Яновский (вместе с Крюковым, Паппенгеймом, Феррата и др.) полагали, что "моноцит это понятие не однородной клеточной формы, а собирательное понятие для различных, близких по внешним морфологическим признакам, но неоднородных по происхождению клеток" (1963). На существование нескольких разновидностей Мн и Мф впоследствии указывали и другие авторы (Архипов С.А., 1995; Шубникова Е.А., 1981; Суслов А.П., 1984; Epstein W., Fukuyama К., 1989; Ryu J. et. al., 1992; Williams G.T., Williams W.J.,1983; и др.).

Вопрос о возможности идентификации ранних клеток-предшественниц ЭК в крови или других биологических жидкостях (перитонеальный экссудат и т.п.) никем до настоящего времени серьезно не рассматривался, поскольку предполагалось, что детерминация Мн в направлении ЭК-дифференцировки может происходить только в "ткани-мишени", пораженной патологическим процессом. Предположение, высказанное G. Williams и W.Williams (1983), о том, что ЭК дифференцируются из каких-то особых специализированных в определенном направлении Мн, не было подкреплено в свое время конкретными фактами.

В результате проведенных исследований впервые автором показано, что определенная субпопуляция Мн крови в норме уже является коммитированной в ЭК-направлении дифференцировки. На основании полученных данных разработан способ идентификации клеток-предшественниц ЭК (пре-ЭК) в мазках крови по некоторым цитоморфологическим характеристикам, отличающих пре-ЭК от незрелых клеток миелоидного ряда и Мн - предшественников Мф. Таким образом, появляется возможность выявлять клетки-предшественницы ЭК в периферической крови и оценивать их количество в организме при самых различных заболеваниях, при которых развиваются ЭК-гранулемы. Выявление пре-ЭК в мазках крови в динамике гранулематозных болезней позволит разрабатывать новые методы их диагностики, а также новые методы оценки эффективности лечения гранулематозных болезней.

Задача изобретения. Разработать способ идентификации коммитированных клеток-предшественниц ЭК в мазках крови человека и животных (млекопитающих).

Цель изобретения. Разработать способ идентификации коммитированных клеток-предшественниц ЭК в мазках крови человека и животных, позволяющий выявлять коммитированные клетки- предшественницы ЭК в организме человека и животных в норме и при патологических ЭК-гранулематозных процессах, что необходимо для разработки новых методов дифференциальной диагностики гранулематозных болезней, а также новых методов оценки эффективности их лечения.

Прототип изобретения отсутствует (ранее была подана заявка на изобретение "Способ идентификации клеток-предшественниц эпителиоидных клеток" /во фракционированной крови и других биологических жидкостях/, автор - С.А.Архипов).

Сущность способа состоит в цитоморфологическом исследовании мазков крови человека или животных (млекопитающих), приготовленных по общепринятой методике на предметных стеклах (Кост Е. А./Ред., 1975), фиксированных метанолом и окрашенных комбинированной окраской Май-Грюнвальда-Романовского-Гимза по Паппенгейму в модификации Стражеско Н.Д. и Яновского Д.Н. (1963), включающим одновременную оценку ряда цитоморфологических критериев: размеры и форму клетки, размеры и форму ядра, расположение ядра в цитоплазме, ядерно-цитоплазматическое отношение, окраску ядра и цитоплазмы, наличие зернистости в цитоплазме, особенности строения ядерного хроматина, наличие и особенности ядрышка.

Мазки крови, приготовленные на предметных стеклах, высушивают при комнатной температуре в течение 1 часа, фиксируют в метаноле в течение 10 минут, окрашивают готовой краской Май-Грюнвальда, разбавленной дистиллированной водой (1: 1), в течение 10 мин, мазки ополаскивают дистиллированной водой и докрашивают краской Романовского-Гимза (0,05 мл готовой краски на 1 мл дистиллированной воды) в течение 10-15 минут. Окрашенные мазки ополаскивают дистиллированной водой, подсушивают и исследуют при помощи светового микроскопа, используя обычные объективы (для поиска клеток по размерам и обшей морфологии клеток) и иммерсионные объективы для цитоморфологического анализа клеток.

Клетки, одновременно удовлетворяющие следующим цитоморфологическим характеристикам, являются ранними коммитированными клетками-предшественницами эпителиоидных клеток. Коммитированные клетки-предшественницы ЭК - это относительно крупные клетки с диаметром 17-21 мкм, имеющие круглое или овальное эксцентрично расположенное ядро с одним небольшим ядрышком неправильной формы; ядерно-цитоплазматическое отношение ≥1; поверхность ядра сглажена и не имеет глубоких вдавлений; хроматин ядра тонкоструктурный, равномерной плотности, пикноз хроматина не выражен. Форма клетки слабо асимметричная с признаками поляризации в направлении от поверхности ядра, близко прилегающего к цитоплазме, к противоположной стороне цитоплазмы, имеющей как правило конусовидную форму. Цитоплазма слабо базофильна. В цитоплазме выявляется в небольшом количестве тонкая азурофильная зернистость.

Пример 1. Из хвостовой вены интактных мышей линии BALB/c и мышей BALB/c, которым предварительно (за 7 суток) был введен подкожно полный адъювант Фрейнда (по 0,1 мл готового адъюванта под кожу правого и левого бока), была получена кровь. Введением адъюванта Фрейнда у мышей второй группы индуцировано местное подкожное гранулематозное воспаление с формированием зрелых ЭК. На предметных стеклах сделаны мазки крови. Мазки крови подсушены, зафиксированы метанолом и окрашены методом комбинированной окраски Май-Грюнвальда-Романовского-Гимза по Паппенгейму. Проведен цитоморфологический анализ мазков крови. В мазках крови выявлены клетки с диаметром 19-21 мкм, имеющие круглое или овальное эксцентрично расположенное ядро с одним небольшим ядрышком неправильной формы; ядерно-цитоплазматическое отношение ≥1; поверхность ядра сглажена и не имеет глубоких вдавлений; хроматин ядра тонкоструктурный, равномерной плотности, пикноз хроматина не выражен; цитоплазма слабо базофильна, в цитоплазме выявляется в небольшом количестве тонкая азурофильная зернистость; имеются признаки поляризации цитоплазмы. Все клетки, обладающие такими характеристиками, идентифицированы как клетки-предшественницы эпителиоидных клеток. На 10000 лейкоцитов интактных мышей приходилось 1-2 клетки с фенотипом клеток-предшественниц эпителиоидных клеток (1,3±0,4, n= 3). На 10000 лейкоцитов крови мышей с подкожно индуцированным гранулематозным воспалением приходилось 7-12 клеток с фенотипом клеток-предшественниц эпителиоидных клеток (9,7±1,8, n=3).

Пример 2. Получены мазки крови (из пальца) практически здорового человека. Мазки высушены, зафиксированы метанолом и окрашены методом комбинированной окраской Май-Грюнвальда- Романовского-Гимза по Паппенгейму. Проведен цитоморфологический анализ 3-х мазков крови по критериям, установленным для клеток- предшественниц эпителиоидных клеток. В результате цитоморфологического анализа 10000 лейкоцитов выявлена 1 клетка с фенотипом клеток-предшественниц эпителиоидных клеток.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Архипов С.А. Некоторые результаты исследования закономерностей трансформации мононуклеарных фагоцитов в эпителиоидные клетки in vitro // Тез. докл. научной сессии НМИ. Ч.1. - Новосибирск: Тип. СО РАМН. - 1995.- С. 8.

Справочник по клиническим лабораторным методам исследования / Под. ред. Кост Е.А. - М.: Медицина, 1975, 383 с.

Стражеско Н.Д., Яновский Д.Н. Атлас клинической гематологии. - М.: Изд. Медицинской литературы, 1963, 181 с.

Суслов А. П. Роль мононуклеарных фагоцитов в деструкции клеток опухолей // Итоги науки техники. Онкология.- M.: ВИНИТИ.- 1984.- Т. 13.- С. 142-210.

Шубникова Е. А. Функциональная морфология тканей.- М.: Изд. МГУ, 1981, 326 с.

Epstein W. L. , Fukuyama K. Mechanisms of granulomatous inflammation.- Immunol. Ser.- 1989.- Vol. 46.- P. 687-721.

Ryu J. H., Vuk-Pavlovic Z., Rohrbach M.S. Monocyte heterogeneity in angiotensin-converting enzyme induction mediated by autologous T-lymphocytes.- Clin. Exp. Immunol.-1992.- Vol. 88, N 2.- P. 288-294.

Williams G. T. , Williams W.J. Granulomatous inflammation a review.- J. Clin. Path.- 1983.- Vol. 36.- P. 723-733.

Изобретение относится к медицине, а именно к гематологии и клинической иммунологии. При использовании световой микроскопии в мазках крови выявляют относительно крупные клетки с диаметром 17-21 мкм, слабоасимметричной формы с признаками поляризации в направлении от поверхности ядра, близко прилегающего к цитоплазме, к противоположной стороне цитоплазмы конусовидной формы, имеющие круглое или овальное эксцентрично расположенное ядро с одним небольшим ядрышком неправильной формы. Ядерно-цитоплазматическое отношение ≥1. Имеют сглаженную и без глубоких вдавлений поверхность ядра, тонкоструктурный ядерный хроматин равномерной плотности без выраженного пикноза, со слабо базофильной цитоплазмой, имеющей в небольшом количестве тонкую азурофильную зернистость. При этом все клетки, удовлетворяющие одновременно всем перечисленным критериям, относят к коммитированным клеткам-предшественницам эпителиоидных клеток. Способ позволяет идентифицировать ранние коммитированные клетки - предшественницы эпителиоидных клеток в мазках крови животных и человека в норме и патологии.

Способ идентификации клеток-предшественниц эпителиоидных клеток в мазках крови, отличающийся тем, что мазки крови, приготовленные на предметных стеклах, высушивают, фиксируют метанолом, окрашивают методом комбинированной окраски Май-Грюнвальда-Романовского-Гимза по Паппенгейму и при использовании световой микроскопии выявляют относительно крупные клетки с диаметром 17 - 21 мкм, слабо асимметричной формы с признаками поляризации в направлении от поверхности ядра, близко прилегающего к цитоплазме, к противоположной стороне цитоплазмы конусовидной формы, имеющие круглое или овальное эксцентрично расположенное ядро с одним небольшим ядрышком неправильной формы, ядерно-цитоплазматическое отношение ≥ 1, сглаженную и без глубоких вдавлений поверхность ядра, тонкоструктурный ядерный хроматин равномерной плотности без выраженного пикноза, со слабо базофильной цитоплазмой, имеющей в небольшом количестве тонкую азурофильную зернистость, при этом все клетки, удовлетворяющие одновременно всем перечисленным критериям, относят к коммитированным клеткам-предшественницам эпителиоидных клеток.